不同功能状态滋养层对人胚胎生殖嵴干细胞生长作用的实验研究.pdf

西南国防医药2010年8月第20卷第8期 ·815· · 论著 · 不 同功能状态滋养层对人胚胎生殖嵴干细胞生长作用的实验研究 李 欣，刘 尧，李丽君，秦茂林，杨卫兵，李红丽 [摘要] 目的 筛选并建立高效胚胎干细胞滋养层体外培养的最佳条件 ，利于人胚胎生殖嵴原始生殖细胞 (PGC)的增 殖。方法 分离培养孕 14．5d(El4．5d)和新生0d(P0)昆明小 鼠原代胚胎成纤维细胞 (MEF)并传代制备滋养层 ，以 co 射线照射后继续培养并接种人 PGC。采用活细胞拒染法 、免疫细胞化学染色，对比观察滋养层的生长活性和照射后分泌功 能；采用碱性磷酸酶(AKP)染色技术鉴定人 PGCs的生长状态 。结果 (1)El4．5d和 PO来源的第 3～5代 MEF生长旺盛。 ． Po来源第 6代与El4．5d来源同代 MEF相 比深染变形细胞增达 32％，经 co^y照射后衰老细胞明显增多 (P0．05)。(2) El4．5d来源第3～6代和H】来源第3～4代 MEF经 co 照射后培养5d时，I型胶原蛋白免疫阳性细胞数 目较多，染色较 深；但P0来源第5代其阳性细胞数 日明显减少 ，染色变浅。(3)人PGCs接种于El4．5d第 3代制备的滋养层 3～4d后见典 型的ESC小克隆团，细胞呈圆形；AKP染色呈深蓝色团；而接种于 P0来源第6代 MEF制备的滋养层5～6d，可见ESC克隆松 散 、变大，周围边界不清，细胞紊乱。结论 以 co^y射线照射小鼠El4．5d来源第3～6代MEF是制备滋养层的最佳来源 ，可 维持人 PGCs增殖 。 [关键词] 胚胎成纤维细胞；人胚胎生殖嵴细胞 ；滋养层 ；Co 射线 ；小鼠 中图分类号 R329．1 文献标识码 A 文章编号 1004—0188(2010)o8—0815—04 doi：10．3969／j．issn．1004—0188．2010．08．002 Effectsofdifferentfunctionalstatusofmouseembryonicfibroblastfeederlayerson growth ofembryonicstem cellsfrom humangenitalridge LiXin，LiuYao，LiLijun，QinMaolin，YangWeibing，LiHongli 1．DepartmentofDermatology，Hospital181ofPLA，Guilin， Guangxi，541002，China；2．DepartmentofHistoloyg and Embryoloyg ，PreclinicalMedicine ofThird Military MedicalUniversity， Chongqing，400038，China [Abstract] objective Toscreentheoptimizedconditionsoffeederlayersforthecultureofhumanembryonicstemcellsin vitroandtoestablishahigh—performancemethodthatisconducivetotheproliferationofprimordialgerm cells(PGCs)fromhuman genitalridge．Methods Kunmingmouseembryonicfibroblasts(MEFs)isolatedfromthefetusat14．5dofgestation(El4．5d)and newbornsof0d(PO)werecuhuredandpassedinvitroasfeederlayers．Afterradiatedby Co^y—ray，theywereculturedcontinuously andvaccinated with humanPGC．Thegrowthactivityand secretaryfunctionofMEFfeederlayersbeforeandafterirradiationwere observedcomparativelybytrypanbluestainingandim