《蜂蜜中丙三醇含量的测定方法》编制说明.doc

《蜂蜜中丙三醇含量的测定方法》编制说明 一、标准制定的任务来源及意义 1、任务来源 本标准是根据中华全国供销合作总社供销厅函科字[2013]9号文下达的任务，由中华人民共和国江苏出入境检验检疫局负责，名称为《蜂蜜中丙三醇含量的测定方法》，计划编号为2013GH-1-016。 2、制定标准的意义 蜂蜜是一种高度复杂的糖类饱和溶液，其中约 75 %是糖分，约 24 %是水分。文献[1-3]报道蜂蜜中某些适高渗压的酵母菌可将葡萄糖转化成多羟基化合物，如丙三醇、 D-阿糖醇和赤藓醇等。蜂蜜中丙三醇的含量与蜂蜜中存在的微生物数量之间有一定的关系。因此丙三醇含量可以作为衡量蜂蜜品质的一个指标，建立蜂蜜中丙三醇含量测定方法的标准就很有必要。 二、 编制依据 本标准按照《GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分 标准的结构和编写》的要求进行编写。 三、 研究背景及内容 1 研究对象 丙三醇，glycerol，俗称甘油，是一种无色、透明、无臭、粘稠液体。化学式C3H8O3，分子量92.09，CAS登录号56-81-5。丙三醇能与水和乙醇互溶，能溶于乙酸乙酯，不溶于苯、氯仿、四氯化碳和石油醚等。 2 蜂蜜中的丙三醇分析方法现状 食品中丙三醇的分析方法有容量法、比色法、荧光光谱法、液相色谱法、气相色谱法[4 ]和酶分析法[5 ,6 ],上述方法中，适用于蜂蜜样品的有液相色谱法、酶分析法，衍生化-气相色谱-质谱联用法[7]。胡小钟等人[7]采用N ,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（BSTFA）作为衍生试剂，对蜂蜜中的丙三醇进行硅烷化衍生反应，对衍生产物进行气质联用分析。 丙三醇的硅烷化衍生产物在气质联用仪上的响应高，且能与其他的多羟基化合物有效分离，抗干扰能力强。本标准对提取方法、硅烷化反应的条件、仪器条件进行了考察优化，并引入内标物1,2,4-丁三醇，对提取过程、衍生反应和离子化过程进行校正，采用内标法定量，进一步提高了定量的准确性。 3 提取方式考察 3.1提取溶剂的选择 提取溶剂应对蜂蜜样品和丙三醇有较好的溶解性，能最大限度的提取蜂蜜样品中的丙三醇。同时，提取溶剂应不与衍生试剂BSTFA发生反应。因此，排除极性较小的正己烷、石油醚、苯、四氯化碳等溶剂，以及水、甲醇、乙醇等含羟基溶剂。 3.1.1 提取溶剂的溶解能力 根据上述原则，本标准选择了N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、二甲亚砜（DMSO）、吡啶和四氢呋喃四种溶剂进行考察。结果发现四氢呋喃不能溶解蜂蜜，其他三种溶剂能够完全溶解蜂蜜。因此，在后续研究中只考察DMF、DMSO和吡啶三种溶剂。 3.1.2 提取溶剂对衍生的影响 在同等的加标水平下，分别考察蜂蜜加标样品在上述三种溶剂提取后的衍生效果。将阴性蜂蜜样品充分搅拌均匀，称取1. 0 g 于50 mL 干燥离心管中，加入内标物10 mg/mL的1,2,4-丁三醇50 μL，添加10 mg/mL丙三醇50 μL，涡旋混匀，用量筒准确加入25 mL 不同衍生试剂（N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、二甲亚砜（DMSO）、吡啶，需提前加入无水硫酸镁除水），加盖涡旋使其充分溶解（如有必要需用手猛烈振摇），超声15min。准确量取0.05 mL溶液，加入衍生试剂N ,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（BSTFA）0.05 mL，涡旋1min，室温下静置10 min 后，加正已烷0.9 mL，定容至1.0 mL，加盖涡旋，高速离心，上层清液用吸管吸出，供气质联用仪测定。 衍生后色谱图见图1-图3。 图1 以吡啶为提取溶剂的衍生图谱 图2以DMSO为提取溶剂的衍生图谱 图3以DMF为提取溶剂的衍生图谱 由图1-3可见，三种提取溶剂下，丙三醇的衍生产物峰面积相当，以DMF为提取溶剂时，丙三醇衍生产物峰面积略高一点；丁三醇的衍生产物峰面积：DMFDMSO吡啶。且吡啶和DMSO做提取溶剂时，衍生副产物较多，色谱图上杂峰较多。 最终确定DMF作为提取溶剂。 3.2 提取方式 为了尽量完全的提取蜂蜜中的丙三醇，需要使蜂蜜完全溶解在溶剂中，常用的提取方式有：涡旋、超声、振荡等。蜂蜜样品的粘稠度各不相同，对于比较稀的蜂蜜样品，涡旋和超声可以使之充分溶解；对于比较粘稠的样品，仅靠涡旋和超声不足以使其溶解，这时候需要用手猛烈振摇。 为了保证溶剂对蜂蜜中丙三醇的提取效率，最终确定涡旋、振摇和超声结合的方式，来确保蜂蜜充分溶解于溶剂。 3.3 试剂和容器的除水 由于水会消耗硅烷化试剂BSTFA，而DMF溶剂自身会含有少量水分，且放置过程中可能会吸收空气中的水分，因此DMF在使用前要加入适量无水硫酸镁做除水处理。同理，实验过程中用到的所有容器都应干燥。 经考察确定的提取方法如下：将蜂蜜样品充分搅拌均匀，称取1. 0 g 于50 mL 干燥离心管中，加入内标物10