实用柱层析技术.ppt

柱层析技术的讨论 基本原理 色谱法的分离原理就是利用待分离的各种物质在两相中的分配系数、吸附能力等亲和能力的不同来进行分离的。  由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中先后流出。与适当的检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。 塔板理论 基于热力学的塔板理论 它是色谱学的基础理论，塔板理论将色谱柱看作一个分馏塔，待分离组分在分馏塔的塔板间移动，在每一个塔板内组分分子在固定相和流动相之间形成平衡，随着流动相的流动，组分分子不断从一个塔板移动到下一个塔板，并不断形成新的平衡。一个色谱柱的塔板数越多，则其分离效果就越好。 塔板理论 理论塔板高度越低，在单位长度色谱柱中就有越高的塔板数，则分离效果就越好。 决定理论塔板高度的因素有：固定相的材质、色谱柱的均匀程度、流动相的理化性质以及流动相的流速等。 塔板理论 塔板理论是基于热力学近似的理论，在真实的色谱柱中并不存在一片片相互隔离的塔板，也不能完全满足塔板理论的前提假设。 塔板理论虽然能很好地解释色谱峰的峰型、峰高，客观地评价色谱柱地柱效，却不能很好地解释与动力学过程相关的一些现象，如色谱峰峰型的变形、理论塔板数与流动相流速的关系等。 分类 柱层析方法分类： 吸附色谱柱：吸附剂，洗脱剂（流动相）； 分配色谱柱（萃取原理）：载体，固定相，流动相； 离子交换树脂柱； 凝胶柱 吸附色谱柱较为常用，下面重点讨论 吸附剂 硅胶 中性、酸性，比较适合分离中性或酸性物质 粒度100~200目，200~300目，300~400目，更高 氧化铝 酸性，适合分离酸性物质 中性，pH值7.5，适合分离碱性物质 碱性，pH值10，适合分离碱性物质 聚酰胺 硅藻土 活性炭 吸附剂的选择 中性、酸性物质优先试用硅胶分离，如果效果不好可以使用氧化铝 碱性物质也可以使用硅胶分离，但需要用三乙胺等碱性物质碱化吸附剂 如果选择氧化铝分离，需要使用氧化铝TLC板点板，使用硅胶板不能准确选择流动相体系 吸附剂的选择 吸附剂目数的选择 对于Rf值0.4的杂质，可以选择目数100~200的硅胶 对于Rf值在0.2~0.4的，一般用200~300目 对于Rf值在0.1~0.2的，用300~400目 对于Rf值0.1的，需要更多的吸附剂用量、较小的流动相体系、较长的时间 吸附剂的选择 吸附剂的量的选择 一般为5~40倍 常用的为10~20倍 由流动相体系、吸附剂目数综合决定。 流动相体系 正己烷和石油醚环己烷四氯化碳三氯乙烯二硫化碳甲苯苯二氯甲烷氯仿乙醚乙酸乙酯丙酮丙醇乙醇甲醇水吡啶乙酸 极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统（有时样品溶解性差的可以加入二氯甲烷） 极性较大的用 甲醇：氯仿系统 极性大的用 甲醇：水：正丁醇：醋酸系统 流动相体系的选择 首先从待分离物质的结构上判断 极性基团较多的，如胺基、羧基，选择极性较大的体系。一般为甲醇：氯仿体系 可形成氢键部位较多的，应选择极性较大的流动相体系 脂溶性集团较多的，一般乙酸乙酯：石油醚体系就可以 流动相体系的选择 可替换的流动相体系 考虑到物质的溶解性和极性变化，上述流动相体系还可以做一些变化： 乙酸乙酯：石油醚—丙酮：石油醚—二氯甲烷:(乙酸乙酯)：石油醚—乙酸乙酯：正己烷（价格贵不推荐） 甲醇：氯仿—甲醇：二氯甲烷—乙醇：二氯甲烷 比如，有的物质在乙酸乙酯里溶解度很差，上柱后样品不能有效的溶解在流动相中，影响分离，可以改用丙酮、二氯甲烷、或者三种溶剂同时混合使用 比如，使用甲醇：二氯甲烷体系极性较大时，可以改换乙醇：二氯甲烷体系，就可能得到较好的分离效果 流动相体系的选择 由TLC实验数据推断柱层析流动相配比： 在选择一定的流动相的前提下，调整流动相组分或比例，使目标物的Rf值为0.5，与邻近杂质的分离度至少在0.1以上（当然是越大越好，Rf达到0.2~0.3就很容易分离了） 根据所选的吸附剂的目数 因为TLC是高效板，硅胶柱的分离效果较差，所以一般需要在TLC流动相的基础上放大5~10倍，甚至更多才可以得到相似的分离度 流动相体系的选择 特殊样品：会造成拖尾，严重影响分离效果 碱性物质 先用千分之一到百分之一的氨水、三乙胺或者氨甲醇，碱化柱子 酸性物质 洗脱剂中加千分之一的醋酸，或苯磺酸 层析柱的选择 关于柱子的尺寸，应该是粗