第十章植物的基因工程.ppt

第十章植物的基因工程 10.1再生植物 10.1.1植物在遗传工程方面的优缺点 10.1.2单个细胞可生长成完整植株 10.1.3用叶盘再生植株 10.2植物基因转移的途径 植物基因转化是利用分子生物学和基因工程技术将外源基因插入到受体植物的基因组,并使其在后代植株中得以表达的过程。 1974年,人们发现根癌农杆菌在感染植物时,可将其中环状的Ｔｉ质粒的一段ＤＮＡ插入植物基因组中,引起植物遗传特性的变化。从此,人们开始尝试利用这种天然的载体系统,将外源基因导入植物细胞,并利用植物细胞的全能性,借助于细胞培养或组织培养技术,使转化细胞垌生成完整的转基因植株,从而实现外源基因对植物的遗传转化. 目前,已有百余种转基因植物问世。在众多的转基因植物中80%是由农杆菌介导转化的。目前农杆菌已成为植物基因转化的首选方法. 农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌。现已发现,与植物基因转化有关的有两种类型:一为根癌农杆菌(Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ),它含有Ｔｉ质粒,能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤,即诱发冠瘿瘤;二为发根农杆菌(ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ),它含有Ｒｉ质粒,能够诱导被侵染的植物细胞产生毛发状根。 冠樱瘤是由一些土壤农癌杆菌细菌在感染部位形成的植物肿瘤.当受伤的植物被土壤农癌杆菌感染时,土壤农癌杆菌并不进入植物细胞,而是把一种环状染色体肿瘤诱导质粒(Ti)中的T-DNA片段转移入细胞.来自天然Ti 质粒内的基因表达,其表达产物刺激细胞无休止分裂.由快速分裂细胞形成的结构叫做冠樱瘤. 在冠樱瘤细胞中，具有大量的不正常的氨基酸类物质——冠樱碱，这是一类相对质量较小的碱性氨基酸衍生物，由Ti质粒编码。 正常植物不能合成和利用冠樱碱，而土壤农癌杆菌能够选择的利用这类化合物作为自己唯一的能源，碳源和氮源。 植物基因转化必须有Ｔｉ质粒上Ｔ-ＤＮＡ和ｖｉｒ基因即毒性区两部分的参与。 Ｔｉ质粒上有一段转移ＤＮＡ(ｔｒａｎｓｆｅｒＤＮＡ,又称Ｔ-ＤＮＡ),在杆菌侵染植物时,这段ＤＮＡ可以插入到植物基因组中,使其携带的基因在植物中得以表达。 Ｔ-ＤＮＡ上较重要的是Ｔ-区两端左右边界各为25ｂｐ的重复序列。其中14ｂｐ是中心,分10ｂｐ和4ｂｐ两组,是完全保守的。这两个边界是Ｔ-ＤＮＡ转移所必需的。 T-DNA所携带的基因主要有两个功能： 一是决定肿瘤的形成和形态； 二是控制冠樱碱的合成。 Ｔｉ质粒的ｖｉｒ区大小为30ｋｂ,分ＶｉｒＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ等7个操纵子,一共有24个基因共同控制着Ｔ-ＤＮＡ的加工和转移,它们总称调控子。 Vir基因功能是决定土壤农癌杆菌对植物的感染以及T-DNA的进入和整合。 主要过程包括: 1)细菌对植物敏感细胞的识别和吸附并对信号物质的感受； 2)Ti质粒上的vir基因被激活; 3)T-DNA切割和T-DNA复合物形成; 4)T-DNA复合物由农杆菌进入植物细胞; 5)T-DNA整合到植物染色体上并进行表达。 直接使用Ti质粒存在的困难 一是Ti质粒相对分之质量太大（200kb),限制酶位点多，不易进行体外重组DNA的操作； 二是被T-DNA转化的植物细胞成为肿瘤细胞，不能进行分化，再生成植株。 对Ti质粒进行改造原则 保留T-DNA的转移功能； 取消T-DNA的致瘤性，使之进入植物细胞后不至于干扰细胞的正常生长和分化，转化体可再生植株； 通过简便的手段可使外源DNA插入T-DNA之中，并随着T-DNA 整合到植物染色体上。 农杆菌Ｔｉ质粒载体系统 目前,人们已经构建成了若干种能应用于植物基因转化的农杆菌Ｔｉ质粒载体系统。所有这些系统都包括了两个基本要素。第一,组成一个重组的质粒载体。它含有Ｔ-ＤＮＡ的边界序列,而且这个质粒还能够在大肠杆菌和农杆菌之间进行穿梭。这是由于Ｔｉ质粒是一个大质粒,很难在其上进行普通的基因克隆操作,必须使用一种中间载体质粒,在大肠杆菌上进行普通的基因操作,连接上外源基因,然后转移到土壤农杆菌中,与相应的ＤｉｓａｒｍｅｄＴｉ质粒共同作用组成一个完整的Ｔｉ质粒载体系统。第二,作为载体系统的质粒及农杆菌株必须含有完整的ｖｉｒ基因。 目前,在植物基因转化中应用最多的Ｔｉ质粒载体系统有共整合载体系统和二元载体系统。 共整合载体是指Ｔｉ质粒上编码致瘤基因的序列被一段ｐＢＲ322ＤＮＡ所取代,带外源基因的ｐＢＲ322衍生中间载体由大肠杆菌转入农杆菌后,二者相同的ｐＢＲ322序列发生同源重组,外源基因就此整合到ｄｉｓａｒｍｅｄＴｉ质粒上。 在国际上最早获得广泛应用并有显著成效的植物基因工程载体是pGV3850，它是一种经过改造的Ti质粒。 其特点是：