大豆三种不同遗传转化方法的优化研究Optimization of three different genetic transformation methods for soybean.pdfVIP

大豆三种不同遗传转化方法的优化研究 Optimaization of three different soybean genetic transformation systerms 学科专业：遗传学 研 究 生：钟 影 指导教师：王 罡 教授 天津大学环境科学与工程学院 二零一四年五月 万方数据 万方数据 摘 要 大豆是我国重要的农作物之一，在工农业生产中占有重要地位，现阶段我国 大豆供给将近50%依赖于进口。影响我国大豆种植的一个重要原因就是草害，抗 除草剂基因的发现和基因工程技术为解决这一问题提供了新的思路。由于多种原 因，比如大豆再生困难，大豆遗传转化研究缓慢。 本文首先以大豆胚尖为外植体，对胚尖不定芽再生过程中草甘膦的最适耐受 浓度进行了确定，实验表明在不定芽伸长阶段，吉育91 合适的筛选浓度为15 mg/L，黑农37 和合丰35 为7.5 mg/L，黑农35 和黑农44 为5.0 mg/L ，生根阶段 以1.5 mg/L 作为最适筛选浓度。在农杆菌介导的遗传转化下，研究激素浓度对 胚尖不定芽的影响，结果表明不同大豆基因型胚尖伸长的最适培养基激素浓度不 同，黑农37 适于于0.05 mg/L 6-BA 培养基，黑农44 适于于仅含有0.2 mg/L IBA 的培养基，合丰35 适合于0.05 mg/L 6-BA + 0.1mg/L IBA 激素组合。研究发现， 适当的超声波处理对胚尖不定芽的再生无显著影响。利用该遗传转化方法，最终 获得T0 代PCR 阳性植株15 株，T1 代PCR 阳性植株16 株，T2 代阳性植株9 株。 其次，研究了大豆未成熟子叶的体细胞胚胎发生受接种方式及光照的影响， 结果表明各基因型的体细胞胚胎的发生均受接种方式影响，合丰25 、吉林35 和 吉育91 以近轴面向上的方式培养的体细胞胚胎发生率显著高于近轴面向下的接 种方式；同时各基因型的胚胎发生对光照要求各不同，吉育91 与合丰25 体细胞 胚胎的发生更适合于强光照，黑农44 在黑暗下利于胚胎发生，吉林35 未成熟子 叶体细胞胚胎发生对光照不敏感。对基因枪遗传转化过程中，高渗剂对大豆体细 胞胚胎发生的影响的研究发现，不同的基因型受不同高渗剂种类处理，胚胎发生 率有显著不同，黑农44 、合丰25 较适合使用0.4M 甘露醇处理，泗豆4 号更适 合于0.2M 甘露醇+0.2M 山梨醇的混合处理方式，黑农40 适合用0.4M 山梨醇或 0.2M 甘露醇+0.2M 山梨醇。经该方式遗传转化后，获得PCR 阳性植株12 株。 最后，本论文尝试了生长点微创伤遗传转化法，对种子消毒时间及培养条件 进行了探索，最终确定以7~9h 为最佳灭菌时间，以水种比为10:15 为最佳培养 组合，该方法处理外植体约3000 粒，对120 棵T1 代植株进行PCR 检测，获得 阳性植株4 棵。 关键词： 大豆 农杆菌 基因枪 未成熟子叶 基因刷 万方数据 ABSTRACT Soybean is one of the important crops in China，which occupies an special position in the industry and agriculture