腺联病毒AAP5和禽腺联病毒VP3的原核表达及单克隆抗体制备Prokaryotic expression and monoclonal antibody preparation of adenoassociated virus AAP5 and avian adenoassociated virus VP3.pdfVIP

刘晓娟：腺联病毒AAP5和禽腺联病毒VP3的原核表达及单克隆抗体制备 l 腺联病毒AAP5和禽腺联病毒VP3的原核表达及单克隆抗 体制备 硕士研究生：刘晓娟 导师：孙怀昌教授 中文摘要 作为基因转移的载体，腺联病毒(adeno—associatedvirus，AAV)具有外源基因表达稳 定、感染细胞类型多、无致病性、免疫原性低等优点，重组AAV载体在基因治疗研究中 受到越来越多的重视。目前对于AAV基因组复制的研究较为详细，但病毒装配的研究很 主要成分，也是决定AAV血清型的主要蛋白质：0RF2编码病毒装配活性蛋白(AAP)。 本研究主要为进一步研究AAV各亚型和VP3蛋白之间的关系提供有效的生物工具。 本研究以含有5型AAV V为模板，PCR扩增禽腺联病毒VP3编码序列 AAP编码序列(AAP5)；以pCRAA 分析结果表明表达的AAP5蛋白为预期的44KD，主要存在于重组菌裂解物离心后的上清 中；AVP3蛋白为预期的81KD，主要以包涵体形式存在。用镍柱亲和层析法分别从重组 菌裂解物纯化得高纯度的AAP5蛋白和AVP3蛋白，并分别免疫小鼠，每次免疫后采血分 离血清，以重组蛋白AAP5和AVP3为包被抗原，用方阵试验确定最佳抗原包被浓度和最 佳血清稀释倍数，用建立的间接ELISA对免疫小鼠血清进行检测。结果显示：3次免疫 融合，用ELISA筛选杂交瘤细胞阳性克隆，再用有限稀释法进行亚克隆，经过三次亚克 隆后，两种蛋白分别获得两株稳定分泌AAP5和AVP3单克隆抗体的杂交瘤细胞株。再以 Blotting 检测，结果显示分泌的单克隆抗体都能与相应的免疫原AAP5蛋白或AVP3蛋白发生特异 反应。分别用两株分泌AAP5单抗的杂交瘤细胞和两株分泌AVP3单抗的杂交瘤细胞注射 和2博，AVP3腹水单抗的ELISA效价分别为29和29。 关键词：腺联病毒；AAP5蛋白；AVP3蛋白：原核表达；单克隆抗体制备 扬¨l大学硕士论文 2 andMonoclonal of Expression AntibodysPreparation Adeno—AssociatedVirusAAP5andAvian VirusVP3 M．S．Candidate：Liu Xiaojuan Supervisor：Prof．SunHuaichang Abstract Asa transfer virus(AAV)has vector,Adeno·associated gene many stable of ofa cell tothe expressionforeigngenes，infectionmultipletypes，nonpathogenicity AAVhas moreandmore in hosts，low attention immunogenicity．Recombinantgotten