微球为荧光富集载体的DNA及蛋白激酶传感器研究Study on DNA and protein kinase sensor of microspheres as a fluorescent enrichment carrier.pdfVIP

摘 要 摘 要 均相荧光传感器因其灵敏度高、数据易读取、样品量小、操作简便，在金属离子、 核酸以及其他生物分子的选择性检测中被广泛应用。然而，受限于复杂生化体系中的强 散射和高荧光背景，均相荧光传感器并不适用于诸如血清等实际样品的临床分析；此外， 均相荧光传感器难以器件化、只能一次性使用、检测体系容易被污染等缺点也限制了其 实际应用。以功能化的微球为生化反应及信号富集的载体构建各类生物传感技术，可方 便地实现与复杂基质的分离而避免干扰，该类方法目前已成为对复杂介质中生物分子进 行检测的重要手段。本论文以微球作为荧光信号富集基体，在DNA 及蛋白激酶活性分 析方面进行了积极的探索。 高灵敏度脱氧核糖核苷酸（DNA ）检测在遗传性疾病早期诊断和基因工程中起着重 要作用，因此，对于快捷、简便的DNA 检测方法的研究也在不断深入。本文以链霉亲 和素（streptavidin，STV）修饰的磁性微球Dynabeads M-270 为荧光富集载体，通过STV 与生物素（Biotin ）的特异性结合将目标 DNA 的茎环结构检测探针（Bio-H1 ）富集于 M-270 微球表面。当目标DNA 存在时，Bio-H1 的粘性末端会与其杂交配对，进而茎环 结构被打开。经磁分离后，茎环结构展开所形成的新的粘性末端可以继续引发体系中荧 光标记的两种茎环结构 DNA 交替发生杂交链式反应 （Hybridization Chain Reaction ， HCR ），在微球表面富集大量荧光信号，达到了信号放大的目的。经流式细胞仪检测， 该传感器的检测限达到了0.5 pmol/L ，比传统微球传感器灵敏度高三个数量级；与此同 时，该传感器的特异性高，在复杂生化体系中的应用也得到了验证。 蛋白激酶在细胞内的信号转导过程中扮演着重要的角色，由激酶活性过强所引起的 蛋白磷酸化异常会导致包括癌症在内的很多疾病。因此，对蛋白激酶活性进行准确检测 对于疾病诊断及靶向药物开发都具有重要意义。本文利用锆离子功能化的二氧化硅多孔 微球为信号富集载体，成功构建了一种高灵敏度检测蛋白激酶活性的方法。微球表面修 饰的锆离子可特异性识别并结合别蛋白激酶催化生成的磷酸化荧光底物多肽，而与未磷 酸化的多肽无相互作用。因此，蛋白激酶活性与微球富集的荧光信号呈正相关。通过对 微球表面的磷酸化多肽进行洗脱并检测其荧光强度，即可实现蛋白激酶活性的灵敏检 测。该传感器操作简便、特异性高，避免了复杂生化体系对测定的影响，为生物样品中 蛋白激酶的测定以及激酶抑制剂的筛选提供了新的途径。 I 摘 要 关键词 荧光 传感器 脱氧核糖核苷酸 杂交链式反应 流式细仪 蛋白激酶 II Abstract Abstract The properties of high sensitivity, easy readout, low sample volume and handy separation make the homogeneous fluorescent sensors widely used in the specific detections of metal ions, nucleic acids and other bio-molecules. However, a majority of the homogeneous fluorescent sensors are not suitable for the analysis of complex biological samples due to the strong light scattering and autofluorescence background in th