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实验22 含氮化合物的微生物转化
实验22 含氮化合物的微生物转化
在土壤和水体中,有机态氮一般占全氮量的95%以上。经微生物的作用,含氮有机物分解产生氨(氨化作用),氨可被氧化成硝酸盐(硝化作用),硝酸盐又可被还原成氮气(反硝化作用),由此构成氮素循环。其中氨化作用、硝化作用和反硝化作用在氮素转化中意义重大。
一、目的和要求
1.认识氨化细菌,并掌握用奈氏(Nessler)试剂和石蕊试剂测定氨化作用的方法。
2.认识硝化作用和反硝化作用,掌握观察硝化作用和反硝化作用的实验方法。
二、基本原理
蛋白质是复杂的含氮有机物,在生物体中普遍存在。它可以被许多微生物(包括细菌、放线菌和真菌)分解而产生氨,称为氨化作用。在不含无机氮的牛肉膏蛋白胨培养基上,所生长的细菌大多是氨化细菌。氨化细菌分解蛋白质释放氨,可用石蕊试剂和奈氏(Nessler)试剂检测。石蕊试剂遇氨呈蓝色,奈氏(Nessler)试剂与氨反应呈棕褐色。
氨氧化成硝酸的过程,称为硝化作用。它由两类细菌分两个阶段进行。氨氧化成亚硝酸的反应由亚硝化细菌引发,而亚硝酸氧化为硝酸的反应则由硝化细菌所致。亚硝酸与格利斯试剂生成绛红色化合物,硝酸与二苯胺试剂生成蓝色化合物,因此用格利斯试剂和二苯胺,试剂可以监测硝化过程。
在无氧条件下,硝酸盐可以被许多微生物还原成氮气,称为反硝化作用。大多数反硝化菌是异样型微生物,能够以有机物为电子供体,将硝酸或亚硝酸逐步还原成氮气。用格利斯试剂和二苯胺试剂可以监测反硝化过程。
三、实验器材
1.样品:菜园土,阴沟污泥。
2.培养基:
(1)牛肉膏蛋白胨培养基1支,装至1.5cm*15cm试管中,每管5ml,经过0.1MPa灭菌20min。
(2)硝化培养基1瓶(见附录),分装至100ml三角瓶,每瓶装30ml,0.1MPa灭菌20min。
(3)反硝化培养基(见附录),分装至1.5cm*15cm试管中,每管10ml,加一杜氏小管,0.1MPa灭菌20min。
3.染色液和试剂:石炭酸复红染液,奈氏(Nessler)试剂,格利斯(Griess)试剂I、II,浓硫酸,二苯胺试剂。
4.仪器及其相关用品:显微镜,香柏油,二甲苯(或1:1的乙醚酒精溶液), 擦镜纸。
5.其他用品:载玻片,盖玻片,吸水纸,酒精灯,接种环,药匙,白色比色碟,滴管,石蕊试剂(红色)等。
四、实验程序
(一)蛋白质氨化作用
1.接种:放一小匙菜园土(约1g)至装有牛肉膏蛋白胨培养液的试管中。
2.悬挂试纸:在试管口内壁上悬挂1条湿润的红色石蕊试纸,然后塞好棉塞。注意试纸不要伸入培养基内。
3.恒温培养:放入28~30’c的恒温培养箱中培养2-3d。
4.检查结果:
(1) 先观察培养管中试纸颜色有无变化,培养液是否混浊或产膜,如红色石蕊试纸变蓝,说明有氨生成,培养液混浊而产膜,说明有大量氨化细菌聚集。
(2)取培养液两滴于比色碟中,加入奈氏试剂一滴,如有棕色或褐色出现,也说明又氨生成。
(3)用接种环曲培养液一环至载玻片上,涂片,固定,染色,在油镜下观察氨化细菌的形态并绘图。
(二) 硝化作用
1.接种:取菜园土1g 左右,接种于盛有铵盐培养液的三角瓶中。
2.恒温培养:放入28~30’c的恒温培养箱中培养7-14d
3.检查结果:
(1)取培养液2滴于比色碟中,加格利斯试剂I及II各一滴,如出现绛红色,则证明硝化作用用第一阶段正在进行,即有亚硝酸产生。
(2)另取培养液2滴于比色碟中。先加入2滴浓硫酸,再加入二苯胺试剂1-2滴(注意添加顺序!),观察有无蓝色出现,如有蓝色出现,说明消化作用第二阶段也在进行。即有硝酸存在。以上结果表明消化作用的两个阶段都在进行当中。若只有红色出现,说明只有消化作用的第一阶段存在:若只有蓝色出现,则说明硝化作用已经彻底完成。
(三) 反硝化作用
1.接种:取反硝化作用培养基1管,放入少许阴沟淤泥,塞上盖子。
2.恒温培养:在28-30’c培养一周。
3.检查结果:
(1)在培养过程中如有氮气产生,则小管中有气体聚集。
(2)取培养液2滴于比色碟,加格利斯试剂I及II 各1滴,如出现绛红色泽证明有反硝化作用产生的亚硝酸。
五、实验安排
(一)蛋白质氨化作用
自实验开始一天后到实验室观察石蕊试纸有没有变蓝,培养液是否浑浊或产膜,如果2—3天后还没有出现现象,则应重做实验。
(二) 硝化作用
自实验开始后第三或四天起每天到实验室取培养液2滴,滴加格利斯试剂I、II进行检验,需观察是否出现绛红色。再取培养液2滴,先加2滴浓硫酸,再加二苯胺试剂1—2滴,观察是否有蓝色出现。若没现象则后一天继续上述操作观察。预计如果第七天后如果仍没有现象或只出现红色,则该重做。
(三) 反硝化作用
自实验开始每天到实验室观察小管中是否有气体聚集现象(说明有N2产生),再取培养液2滴,滴加格利斯试剂I、II
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