构象稳定的破伤风毒素Hc片段突变体（HcM）的制备.PDFVIP

生 物 工 程 学 报 Chin J Biotech 2011, February 25; 27(2): 226−232 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb@ ©2011 CJB, All rights reserved. 医学与免疫生物技术 构象稳定的破伤风毒素Hc 片段突变体 (HcM) 的制备 及其免疫原性分析 于蕊，侯利华，刘树玲，于长明，张晓艳，刘颖，陈薇 军事医学科学院微生物流行病研究所 病原微生物生物安全国家重点实验室，北京 100071 摘 要: 破伤风是由破伤风杆菌侵入人体伤口、生长繁殖、产生毒素而引起的一种急性特异性感染，其死亡率高，严 重危害人民生命健康。研究证实破伤风毒素重链 C 端 (Hc) 具有与毒素受体结合的活性，完全保留了全分子的免疫原 性，有望开发成为新的基因工程破伤风亚单位疫苗以替换传统的甲醛灭活类毒素疫苗。由于野生型 Hc 蛋白 (HcW) 易 形成分子间及分子内二硫键，且各构象分子之间易发生不稳定的转换，为疫苗的生产工艺带来困难，因此，通过将破 伤风 HcW 蛋白的 869 位半胱氨酸突变为丙氨酸，构建构象稳定的破伤风亚单位疫苗突变体 HcM ，对 HcM 进行表达、 发酵和纯化，研究其在不同条件下的稳定性，比较其与受体 GT1b 亲和力的变化及免疫原性。实验结果表明 HcM 在大 肠杆菌中获得了高效可溶性表达，通过 QXL 柱、phenyl-Hs 柱和 source30Q 柱三步纯化，可获得纯度 95 ％以上的HcM 蛋白。纯化后的 HcM 蛋白在不同保存条件下构象稳定且保持了与破伤风毒素受体 GT1b 结合的活性。免疫小鼠后，HcM 能够诱导小鼠产生高滴度抗体并能够保护小鼠抵御 1×103 LD50 剂量的破伤风毒素攻击。以上结果表明构象稳定的 HcM 有望成为新的破伤风重组亚单位疫苗候选者，其生产工艺简单、稳定且保持了与野生型相似的免疫原性，不论是针对 日常破伤风治疗还是对于国家应对突发事件 ( 战争、地震等灾害) 的药品储备均具有重大意义。 关键词: 破伤风，HcM ，构象稳定，亚单位疫苗 Production and immunogenicity analysis of conformation-stable fragment-C mutant of tetanus toxin Rui Yu, Lihua Hou, Shuling Liu, Changming Yu, Xiaoyan Zhang, Ying Liu, and Wei Chen State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity, Beijing Institute of Microbiology and Epidemiology, Beijing 100071, China Abstract: Tetanus is caused by tetanus toxin synthesized by Clostridium tetani. Fragment C (Hc), the 50 kDa carboxy-terminal portion of tetanus toxin, is nontoxic but has receptor protein binding activities, which has been evaluated as a potential new recombinant subunit vaccine to replace the traditional formaldehyde inactivated toxoid vaccine. It is easy for wild Hc (