《动物寄生虫病学》许金俊-实验十 动物原虫病的实验室常规诊断.docVIP

实验十 动物原虫病的实验室常规诊断 一、实验目的和要求 通过实习，掌握动物血液中寄生原虫、肠道内寄生原虫和组织寄生原虫的实验室常规诊断的方法及步骤，了解生殖道寄生原虫的实验室常规诊断的方法及步骤，了解利用动物接种试验诊断原虫病的方法。 二、实验材料 可疑动物的血液、生殖道分泌物、肠道内容物及组织，各种染色液配制，动物接种用实验动物，具体见相应的实验内容及操作部分。 三、实验内容及操作步骤(带*为学生自己操作内容，其余为指导教师进行示教内容) （一） 血液内原虫的检查* 一般用消毒的针头自耳静脉或颈静脉采取血液。此法适用于检查寄生于血液中的伊氏锥虫和住白细胞虫及梨形虫等。 1、鲜血压滴标本检查 将采出的血液滴在洁净的载玻片上，加等量的生理盐水混合，覆以盖玻片，立即用低倍镜检查，发现有运动的可能虫体时，可再换高倍镜检查，由于虫体未染色，检查时应使视野中的光线弱些。此法适用于伊氏锥虫和附红细胞小体。 2、涂片染色检查法 采血滴于载玻片之一端。按常规推制成血片，并使晾干，滴于甲醇2－3滴于血膜上，使其固定，尔后用姬氏或瑞氏液染色，染色后用油镜检查。本法适用于各种血液原虫。 （1）姬氏染色法 [染色液的配制] ①原液 姬氏染色粉0.5g+无水甘油（中性）25ml+无水甲醇（中性）25ml加少量甘油研磨，均匀后加入全部甘油，50～60℃的水浴锅中约2 h，并摇动，完全溶解，装入棕色试剂瓶中，散好放置2.3周后过滤。即为原液。 ②缓冲液和缓冲蒸馏水 为了保证所染的血膜结果良好，必须用缓冲液和缓冲蒸馏水。 甲液：磷酸氢二钠（无水） 9.1g+蒸馏水1000ml 乙液：磷酸二氢钾（无水） 9.07g+蒸馏水1000ml 缓冲蒸馏水：稀释染液和冲洗血膜所用的蒸馏水，以PH7.0～7.2最为适宜。每次应用时宜新鲜配置。甲：63ml+乙：37ml+900ml水（PH7.0），或甲：73ml+乙：27ml+水900ml（PH7.2）. [染色法] 1份原液+10～20份缓冲蒸馏水→染液→染色30min→缓冲蒸馏水轻轻冲洗载玻片上的染液→等干后→高倍镜或油镜检查。 [结果] 锥虫： 细胞原液浅蓝色，生核呈紫色或深红色，动基体呈紫色或红色。梨形虫：细胞质呈蓝色，核的染色质呈紫红色。其他：红细胞呈浅红色，嗜酸性白细胞的颗粒呈红色，淋巴细胞呈蓝色，各种白细胞的核和嗜碱性白细胞的颗粒呈蓝紫色。 （2）瑞氏染色法 [染色液配置] 瑞氏试剂粉0.1～0..5g+（中性）甘油3ml+甲醇97ml，放入甘油后研磨，加入甲醇，充分摇匀，隔24h后即过滤应用。一般1～2周后再过滤应用。 [染色法]（血片不需预先固定）。血膜上加数滴染液 → 2min（相当于固定）后→ 等量中性蒸馏水，混匀，3～5min （染色）→ 清水轻轻冲洗至血膜呈红色为止→ 待干后镜检。 [结果] 大体相同于姬氏染色。 3、虫体的浓集法 当血液中的虫体较少时，用常规血片法不易查到虫体时，可用虫体浓集法。在离心管内加2%柠檬酸钠生理盐水3-4ml，加被检血液6-7ml，充分混匀，先以每分钟500转速离心5min ，弃上清血清，然后将含有虫体、白细胞和少量红细胞的上层血浆，用吸管移入另一离心管内，加适量的生理盐水，再以2500转/分离心10min，吸取沉淀物制成抹片，按上述方法染色镜检。此法适用于伊氏锥虫和梨形虫。 （二）生殖道原虫的检查 1、牛胎儿毛滴虫检查 （1）病料采集：牛胎儿毛滴虫存在于病母牛的阴道和子宫的分泌物，流产胎儿的羊水，羊膜或第四胃内容物和公牛的包皮鞘内，应采取以上病料检查虫体。 在检查虫体时以发现运动活泼的的虫体为准，实验时要注意一下几点：①应该尽量避免其他鞭毛虫混入样品而造成错误诊断。②虫体在低温时活动减弱，因此应该将冲洗液、载玻片等适当加温。③虫体较脆弱，冲洗液应采用无金属离子的生理盐水。④病料采集后要尽快检查。 母畜病料的采集，可采取阴道分泌出的透明粘液，但为了减少污染，自阴道内采取粘液更为合适，可用一直径1厘米长度45厘米的玻管在距离一段12厘米处弯成150度角，消毒备用，使用时将短的一端插入阴道，另一端接一橡皮管，并抽取少量阴道粘液即可吸入管内，取出，两端塞以棉球，带回实验室检查。 公畜包皮冲洗液的收集，应先准备100～～～①取含虫的阴道分泌物于载玻片上。②立即用20℅福尔马林蒸汽固定，约熏一小时左右。③取出，晾干，甲醇固定2分钟。④用姬姆萨染色法染色。⑤水洗，晾干，检查。 苏木精法：固定液和染色液，邵氏固定液：氯化高汞饱和水溶液2份，95℅酒精1份，使用前每100毫升加冰醋酸5～～①将玻片浸于40℃的邵氏固定液中三分钟。70℅酒精中浸泡二分钟。②碘酒精中浸泡10分钟。70℅酒精中浸泡1~2小时。50℅酒精中浸泡5分钟。③流水洗10分钟。