构建携带大鼠脑红蛋白基因慢病毒载体及其目的基因高效表达.pdf

20l3年 8月第3卷第4期 ClainJBrainDisRehabil(ElectronieEdition)，August2013，Vo1．3，No．4 ·23· · 基 础 研 究 · 构建携带大鼠脑红蛋 白基因慢病毒载体 及其 目的基因高效表达 尚爱加 程诚 张月高 冯兴军 周定标 【摘要】 目的 构建携带大鼠脑红蛋白(ratneuroglobin，rNGB)基因的慢病毒真核表达载体 pLenti6／V5．rNGB，转染293细胞，观察外源性NGB在293细胞中的表达情况。方法 应用基因重组 技术。从大鼠脑组织中获得rNGB基因片段 ，重组到pLenti6／V5慢病毒真核表达载体上。pLenti6／V5一 rNGB经病毒包装，转染至293细胞 ，而后行rNGBWesternblot和免疫细胞化学检测。结果 PCR扩 增序列为456bpNGB基因，用Xho．I和BamH-I进行双酶切显示 NGB序列已插入pLenti6／V5慢病毒 表达载体，DNA序列鉴定进一步证实插人基因片段的正确性；293细胞转染pLenti6／V5一rNGB后荧光 显微镜下发出绿色荧光 ，证实慢病毒表达载体转入包装细胞 ；进一步采取 Westernblot方法和免疫组 化方法证实rNGB在包装细胞内有效表达，而pLEGFP—NI转染的细胞只检测到NGB蛋白微弱表达， 两组比较有统计学差异(相对表达量分别为25．324-1．05、0，t=一39．63，P0．01)。结论 构建的 pLenti6／V5．rNGB，经病毒包装转染至293细胞，rNGB和EGFP基因在细胞内有效表达，为pLenti6／V5一 rNGB治疗相关疾病的实验研究奠定了基础。 【关键词】 转染； 慢病毒属；脑红蛋白；病毒包装 ConstructionandexpressionofpLenti6／V5-rNGB in293FT cells SHANGAi-jia，CHENGCheng， ZHANGYue-gao，FENGXing-jun，ZHOUDing—biao．DepartmentofNeurosurgery，ThePLAGeneralHospital， ng100853，China Correspondingauthor：ZHOUDing-biao，Email：shangaj@163．com A【bstract】 Objective Toobselvetheexpressionofratneu~oglobin(rNGB)in293FTcellsbythe wayofconstructingarecombinantplasmid—pLenti6／V5一rNGBwhichcanexpressrNGB．Methods Withthe technologyofgenerearrangement，rNGBgeneobtainedfrom ratbraintissuewassubclonedintopLenti6／V5 vectortogetpLenti6／V5-rNGB，whichwasevaluatedbythemeansofrestrictionenzymeanalysisandDNA sequencing．pLenti6／V5一rNGB and pLEGFP—N1werecotransfected into293FT cellswith lentivira1．After transfection，thecellswereobservedunderfluorescencemicroscope．TheexpressionsofNGB in293FTcells weremeasuredbyWestern Blotand immunocytochemistry．Results Correctconstruction ofpLenti6／V5- rNGBwasidentifiedbyenzymerestrictionanalysisandDNA sequencing．After48houm，htetransfeetedcells emittedgreenfluorescenceunderfluorescencemicroscope．ItWas confirmedthatNGBgenewereexpressedin 293FTcellsbyWesternBlotna dimmunocytochemistr