OATP1B1及CYP2C9基因多态性对氟伐他汀转运代谢影响的分子机制的分析研究.pdfVIP

摘要 摘要 背景： 氟伐他汀是第一个全化学合成的降胆固醇药物，是3一羟基一3一甲基戊二酰辅 酶A(HMG—CoA)J丕原酶抑制剂，适用于原发性高胆固醇及原发性混合型血脂异常 等疾病。CYP2C9为氟伐他汀体内代谢的主要亚酶，OATPlBl则是氟伐他汀进入 肝细胞的转运体。研究显示CYSt．C9和OATPlBl的遗传变异均直接影响其生理功 能，那么此遗传变异是否造成氟伐他汀的代谢转运的变化，从而引起氟伐他汀 疗效和副作用的改变，确实令人关注。故有必要围绕CYP2C9及OATPlBl基因多 态性对氟伐他汀的代谢转运影响展开系统研究，为氟伐他汀的合理应用提供理 论与实验依据。 目的： 本课题拟通过构建野生型及突变型CYP2C9重组酶，研究CYP2C9基因多态 性对氟伐他汀代谢的影响；同时通过构建OATPlBI*5、奎1a和15重组质粒模型， OATPlBl基因多态性对氟伐他汀基于转运代谢影响可能引起的临床疗效的改 变。更好的服务于临床个体化治疗。 方法： 1、摸索和建立氟伐他汀重组酶的生物样本处理和HPLC检测方法。 2、建立氟伐他汀在重组酶中的孵育方法。 3、氟伐他汀在不同基因型CYP2C9重组酶中体外酶促动力学分析。实验分 为空白对照组、CYP2C9·l、CYP2C93重组酶组，通过温孵时间、重组酶浓度、 底物浓度三个方面来考察氟伐他汀在野生型和突变体重组酶的代谢动力学特 征。采用建立的HPLC法测定重组酶体系中氟伐他汀及其代谢产物的量，比较氟 伐他汀在CYP2C9野生型与突变体之间的代谢动力学性质，并采用米氏方程比较 氟伐他汀在野生型和突变体重组酶的代谢动力学参数V。一K。、ClinI等。 4、建立氟伐他汀HEK293T细胞的生物样本处理和LC—MS检测方法。 lJ 摘要 试验。 组，通过按不同时问点考察对摄取过程的影响；通过按不同酶浓度点考察对摄 取过程的影响：通过每组分别加入系列浓度的氟伐他汀，考察底物浓度对摄取 过程的影响。采用建立的LC—MS法测定HEK293T细胞样本中氟伐他汀浓度，考 察三种不同基因型质粒模型中氟伐他汀的摄取动力学过程及其动力学参数(Km、 Vm戤、CLi。。值)，分析两个突变位点对氟伐他汀转运的影响。 7、数据统计分析。统计分析采用SPSS 12．0软件进行数据处理，所有数据均 著性差异，P0．0l为具有极显著性差异。 结果： l、建立的HPLC检测方法完全能够符合重组酶样品的分析测试的要求，具 有高灵敏度。定量下限为0．5uM。 2、建立的氟伐他汀在CYP2C9重组酶中的孵育方法以及样品处理方法完全 能够符合本课题的要求。此方法在多次实验中成功验证，已稳定建立。 uM、 l 11．2士2．1 P450、0．42，通过比较野生 CLi。t值分别为1。91+0。32uM、0。81士0。02pmol／min／pmol 统计分析得出(PO。01)，说明突变型CYP2C93代谢氟伐他汀的活性明显小于 野生型CYP2C9*I。 4、成功的建立了氟伐他汀细胞样品处理方法及细胞样品的LC．MS分析检测 方法，具有高灵敏度和特异性。定量下限为1．0nmol／L。 边界轮廓清晰，胞浆透亮，可见细胞核。通过MTT试验确定氟托伐他汀在1．150uM 范围内对HEK293T细胞毒性小。 III 摘要 6．88土2．01pmol·min～·mg-1 的动力学参数Km、V。。及CLi。t分别为17．46．{-2．05uM、6．32士1．23 pmol-min-1．mg‘1 运能力明显低于OATPlBl木la野生型。 结论： 生型)明显减弱，提示CYP2C9的基因多态性