基于免标记发夹型探针和核酸外切酶_的荧光信号放大DNA检测.docxVIP

Vol．35高等学校化学学报No．82014 年 8 月CHEMICAL JOUＲNAL OF CHINESE UNIVEＲSITIES1646～1651doi:10．7503/cjc于免标记发夹型探针和核酸外切酶Ⅲ的荧光信号放大 DNA检测郭秋平1，2，4，赵下雨1，2，4，谢琴1，2，4，王柯敏1，2，3，4，万俊1，2，4，袁宝银2，3，4，谭誉宇2，3，4(1．湖南大学生物学院，2．化学生物传感与计量学国家重点实验室，3．化学化工学院，4．生物纳米与分子工程湖南省重点实验室，长沙410082)摘要设计合成了一种长臂发夹型核酸探针，结合核酸外切酶Ⅲ水解反应建立了一种免标记荧光信号放大高灵敏检测DNA的新方法．当不存在靶DNA时，SYBＲGreenⅠ荧光染料能够嵌入发夹型探针的茎部而发出 很强的荧光，而当存在靶DNA并与发夹型探针杂交后，核酸外切酶Ⅲ从杂交产物的3端开始水解发夹型探 针，释放出靶DNA，并触发下一个酶水解反应，同时SYBＲGreenⅠ染料也随发夹型探针水解而释放，导致荧光信号降低，从而实现了对DNA的免标记荧光信号放大高灵敏检测．该方法的检出限低至320fmol/L，比传统双标的分子信标的方法降低了4～5个数量级，且该方法还具有免标记、简单、快速的特点．关键词 发夹型探针; 核酸外切酶 Ⅲ; 免标记; 信号放大; DNA 检测中图分类号O657．3文献标志码A高选择性、高灵敏检测DNA在分子诊断、法医调查、遗传学治疗和生物医学等领域均有重要意义［1，2］．然而，DNA通常以极低的丰度存在于复杂的生物环境中，因此发展DNA的信号放大检测方法成为当今的研究热点［3］．近年建立起来的各种基于核酸体外扩增技术的定量分析方法，如聚合酶链式反应(PCＲ)和滚环扩增(ＲCA)等［4，5］均依赖各种聚合酶实现对DNA片段的体外循环扩增，具有极高的检测灵敏度，因而在分子生物学、生物医学与临床诊断中得到广泛应用．但是这些体外扩增技术存在 扩增产物易污染导致假阳性信号、影响因素多和反应重复性差等缺点，限制了其广泛应用．近几年，通过结合新技术和新方法发展了大量的信号放大检测DNA方法，这些方法通过增加标记 探针的数量或增强标记物的信号强度提高检测的灵敏度，而无需对靶分子进行直接扩增，因而在生物化学分析和医学临床检测中发挥了极大的作用．信号放大检测DNA方法根据信号产生方式的不同可分 为荧光法［6～9］、电化学法［10～12］、比色法［13～15］及等离子共振法［16，17］等;根据信号放大手段的不同可分为纳米颗粒信号放大［18～22］，酶或核酶信号放大［23～25］及杂交链式反应信号放大［26，27］等．其中，一种简单、快速的基于核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)的信号放大方法被广泛运用于DNA及生物分子的高灵敏检 测［18～20，28］．与其它限制性内切酶相比，ExoⅢ没有碱基序列依赖性，可以将双链DNA中的单链从3端 (平齐或凹陷)逐步水解，而对单链DNA或3端突出的双链DNA则没有催化活性，因此其更具有普适性，易于发展为通用平台，用于DNA或生物分子的检测具有一定的优势［29］．然而，这些基于ExoⅢ的 核酸信号放大检测方法一般通过对核酸探针进行直接荧光染料或电活性物质标记，或利用纳米材料进行信号的转换［18～20，28］，存在标记困难、价格昂贵或操作繁琐等缺点．本文设计合成了一种长臂发夹型核酸探针，基于ExoⅢ的水解反应，建立了一种免标记的高灵敏荧光信号放大检测DNA的新方法．该方法利用SYBＲGreenⅠ染料能特异嵌入发夹型探针茎部而发出收稿日期:2014-04-04．基金项目:国家自然科学基金重大项目(批准号、国家自然科学基金(批准号、国家“九七三”计划项目(批准号:2011CB911002)、科技部国际合作专项(批准号:2010DFB30300)和湖南省科学技术项目(批准号:2013FJ4042)资助．联系人简介:王柯敏，男，博士，教授，博士生导师，主要从事化学生物传感技术及纳米尺度和分子水平上获取生物化学信息的研究．E-mail:kmwang@hnu．cnNo．8郭秋平等:基于免标记发夹型探针和核酸外切酶Ⅲ的荧光信号放大DNA检测1647较强荧光的特点，避免了对探针的荧光分子标记，同时结合了ExoⅢ可特异性从双链DNA中单链的3端(平齐或凹陷)进行水解，而不水解单链DNA或3端突出的双链DNA的特点，实现了对DNA的荧光信号放大检测，检出限达320fmol/L，为核酸的检测提供了一种简便、快速、高灵敏的分析平台．1 实验部分1．1试剂与仪器靶 DNA: 5-TGGGAGGAGTTGGGGGAGGAGATTAGGTTAAAGGT-3、 点 突 变 DNA: