焦化废水活性污泥中PHB生产菌筛选、鉴定和合成PHB条件探究.doc

焦化废水活性污泥中PHB生产菌筛选、鉴定和合成PHB条件探究 　　【摘 要】PHB（聚β-羟基丁酸酯）由于具有生物可降解性和生物相容性等性质，可以广泛应用在材料、医学、农业和环境保护的领域中。基于在环保领域对PHB的需求量高，希望通过廉价物质作碳源去筛选出PHB的生产菌株，可以大量合成PHB，且降低成本。本研究从焦化废水的活性污泥中提取出菌液，通过几种碳源的培养液中培养，在平板上分离，得到单菌株并再进行复集培养。通过苏丹黑染色法鉴定5种菌株有积累PHB的能力，用硫酸降解法测定菌株产生的PHB的量，选出D2菌，细胞干重高为3.01mg/mL，PHB含量高达17.21%，且十分容易培养。预测所分离培养的D2菌具有培养PHB的工业化前景且节约了成本。 【关键词】PHB；PHB生产菌；分离；鉴定；PHB提取 1.研究背景 1.1 PHB的用途 聚β-羟基丁酸酯（PHB） 作为一种有光学活性的聚酯，除具有高分子化合物的基本特性，如质轻、弹性、可塑性、耐磨性和抗射线外，更重要的是其还具有生物可降解性和生物可相容性。因此，PHB在食品包装、农业、医药和环境保护等领域具有广泛的用途。 在环保领域，通常需要高浓度PHB将有机毒物（如：有机氯化物）吸收浓缩，以便进行下一步处理或回收。然而，虽然目前PHB的生产方法很多如化学合成法、转基因植物生成法、微生物发酵法等等，但是却没有一种低成本、高产量的方法。 1.2 研究目的 本文的最终目的就是通过选育出能够利用廉价物质作碳源高效积累PHB的菌株，从而得到大量生产PHB的方法。 2.试验方法 2.1制备培养基 配制上述的培养基各1 L，摇匀，调节pH在7.0左右。之后放入灭菌锅灭菌20 min，取出放在4 oC冰箱中保存。 2.2 菌株的初步培养 从处理焦化废水的活性污泥中提取菌液，在已配好的各种碳源培养基（同BOD5浓度的乙酸钠、丁酸、葡萄糖、辛酸钠、月桂酸）100 mL中各加1 mL，放入培养摇床，在32oC，180 r/min的条件下，培养48 h。48 h后，若观察到乙酸钠、丁酸、葡萄糖、辛酸钠均变浊，月桂酸比起对照样液混浊许多，则菌株的初步培养成功。 2.3 固体培养基的制备 取上述的液体培养基100 mL，加入琼脂，用玻璃棒混匀后，再放入灭菌锅中灭菌20 min，取出放入4 oC冰箱。 2.4 菌种分离 将上述所培养的菌液，分别稀释到10-5、10-6、10-7、10-8、10-9五个等级，各抽取20μl，接入固体培养基，用涂布棒快速地将其均匀涂布，再放入32oC的恒温箱中培养24 h。24 h后，观察是否长出菌落。 2.5 纯菌富集培养 观察上述的培养24 h的平板，找出单菌落分布比较稀疏，清晰可见的平板，通过菌落的颜色、形状、表面等特征，找出平板上不同种的菌落。将不同种的菌落接入200 mL对应碳源的培养液中。放入32oC的培养摇床中，转速为180 r/min，培养24 h。得到高浓度纯种菌液。 2.6 生产PHB菌株的定性鉴定 把苏丹黑染色液和番红复染液制备后待用。在无菌工作台上吸取各种培养好的单种菌液0.2 mL滴于载玻片上，混匀且涂成薄膜，但注意涂布面不要太大。用钳子夹住载玻片，在电热炉上加热固定，使水分蒸干。滴入苏丹黑染色剂，混匀，室温下染色30 min，发现载玻片呈黑色。用75% 的乙醇清洗2 min，使浮色去掉。滴上番红复染液染色2 min，发现载玻片呈红色，用蒸馏水清洗1 min，使浮色去掉。晾干，在显微镜下观察，若发现有棕黑色或深黑色的类似细胞的颗粒，则可说明，该菌株具有积累PHB的能力。 2.7 菌株生产PHB的定量测定 （1）绘制PHB浓度与吸光度关系的标准曲线。称取0.05g、0.1 g、0.15 g、0.2 g、0.25 g、0.3 g、0.35 g、0.4 g、0.45 g、0.50 g PHB分析纯，均溶于10 mL的氯仿溶液中，再从氯仿溶液中吸取0.1 mL加入10 mL的氯仿中，稀释PHB浓度100倍，再取稀释的PHB氯仿液0.1 mL，滴入10 mL的浓硫酸中，在100oC温度下作用10 min，冷却，混匀，得到对应PHB浓度为0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5μg/ml测定样品。将上述样品置于石英比色皿中，在235 nm波长下，以浓硫酸为空白，测定吸光度。以吸光度为纵坐标，PHB浓度为横坐标，可制得一条标准曲线。 （2）干细胞的烘制。取100 mL的菌液，用离心机在4000 r/min条件下离心20 min，取沉淀物在80 oC烘干至恒重，用电子天平称取干细胞的质量。将干细胞放入-20 oC冰