Cry9Aa和VipAa蛋白对水稻二话螟毒理的协同增效机理研究Study on the synergistic mechanism of cooperation between Cry9Aa and VipAa protein of rice borers toxicology.pdfVIP

万方数据 万方数据 摘 要 苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt ），是一种革兰氏阳性菌，能够 在芽胞期产生伴胞晶体蛋白。由于其具有对非靶标害虫无毒无害、对环境安全等 特点，已经广泛应用于双翅目、鳞翅目和鞘翅目害虫的防治。随着转Bt 作物的 大面积种植，害虫的抗性问题日益严重，蛋白之间的协同增效有助于此问题的解 决。本论文围绕Cry9Aa 蛋白的可溶性改造、最小活性区、纯化最优条件的筛选、 寡聚化的影响、Cry9Aa 蛋白和Vip3Aa 蛋白N 端酶切断裂点分析，以及它们之 间的增效机理等方面进行了研究。 cry9Aa3 基因，是本实验室克隆，对多种鳞翅目害虫有较高活性，Cry9Aa 蛋白在Bt 无晶体突变体中不表达，而在大肠杆菌中主要是以包涵体的形式存在， 上清中表达量极低。本研究通过两个途径对该蛋白进行了改造：（一）通过 BP 和RecA 重组将Cry9Aa 的核心区和Cry1Ac 的C 末端所对应的基因片段融合， 构建融合基因 cry9AaAc，转入 HD73 无晶体突变株，镜检阳性克隆菌株，无晶 体产生，SDS分析菌株总蛋白，未检测到目标蛋白；（二）根据Cry9Aa 蛋白信息学分析结果设计了11 个截短位点，SDS分析各截短蛋白上清表 达量，发现Cry9Aa3-1～654、Cry9Aa3-1～655 蛋白上清表达量显著提高。 通过 Cry9Aa 各截短蛋白对小菜蛾和亚洲玉米螟的活性分析，发现 Cry9Aa I V 对小菜蛾和亚洲亚洲玉米螟的最小活性区相同，均位于45 和654 之间。 通过研究Binding buffer 中咪唑和NaCl 浓度对Cry9Aa 蛋白纯化的影响，最 终筛选出咪唑浓度为50 mmol/L，NaCl 浓度为500 mmol/L 为最优纯化条件。通 过研究不同pH 值、NaCl 浓度与Cry9Aa 蛋白寡聚化之间的关系，明确了高pH 值和NaCl 浓度能够抑制该蛋白的寡聚化，通过研究DTT 对寡聚化的影响，确定 了该蛋白的寡聚化是由分子间二硫键介导的，从而筛选出此蛋白单体稳定存在的 条件是缓冲液必须有1 mmol/L 的DTT 存在。 通过Cry9Aa 和Vip3Aa 蛋白对胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和水稻二化螟的中 肠液的消化试验，发现Cry9Aa 蛋白消化后有约60 kDa 片段产生，Vip3Aa 蛋白 有约62 kDa 片段产生。通过N 端测序和质谱技术，得出Cry9Aa 蛋白的酶切片 段的N 端断裂点位于23K 与24Y 之间，Vip3Aa 蛋白的酶切片段的N 端断裂点位 于39K 与40T 之间。 通过两种蛋白对水稻二化螟的生测，验证了纯化的Cry9Aa 和Vip3Aa 蛋白 的组合对水稻二化螟的增效作用高达35.7 。通过配体垂钓初步分析了它们的受体， 发现它们都有相同的受体氨肽酶，也存在其它不同的结合蛋白。 I 万方数据 关键词：苏云金芽胞杆菌，Cry9Aa 蛋白，Vip3Aa 蛋白，配体垂钓，协同增效 II 万方数据 Abstract Bacillus thuringiensis （Bt), a gram-positive bacterium,can produce crystalline protein during its sporulat