多重定量PCR系统中多色荧光检测和光谱串扰校正方法.docx

多重定量ＰＣＲ系统中多色荧光检测和 光谱串扰校正方法臧留琴１张镇西１苗宝刚２彭年才２＊李政２（）１西安交通大学生命学院生物医学信息工程教育部重点实验室，陕西西安７１００４９２西安交通大学机械学院机械制造系统工程国家重点实验室，陕西西安７１００４９摘要多色荧光的激发检测光路是多重定量聚合酶链式反应（ＰＣＲ）系统的核心组成部分。根据系统对荧光激发的均一性、荧光检测的时间和灵敏度需求，提出一种基于磁光开关和光电倍增管（ＰＭＴ）的多色荧光激发检测光路。 通过四色ＬＥＤ单独激发和ＰＭＴ检测来提高灵敏度；利用磁光效应实现光路的电控切换，配合一维扫描机构和滤光片切换装置，完成９６孔标准ＰＣＲ板的四色荧光扫描。该设计避免了多色荧光光路的系统串扰。由于荧光染料本身光谱特性产生的荧光光谱串扰是通过标准迭代的四维聚类分析算法计算串扰矩阵，并通过４种常用染料的实验研究，对所建荧光检测系统进行荧光光谱串扰评估。关键词光谱学；多重定量；多色荧光检测；光谱串扰校正；磁光开关中图分类号Ｏ４３９文献标识码Ａｄｏｉ：１０．３７８８／ＡＯＳ２０１４３４．０１１７００２ＭｕｌｔｉｃｏｌｏｒＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎｉｎｔｈｅＭｕｌｔｉｐｌｅｘＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲＳｙｓｔｅｍａｎｄＳｐｅｃｔｒａＣｒｏｓｓｔａｌｋＣｏｒｒｅｃｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄＺａｎｇＬｉｕｑｉｎ１ＺｈａｎｇＺｈｅｎｘｉ１ＭｉａｏＢａｏｇａｎｇ２ＰｅｎｇＮｉａｎｃａｉ２ＬｉＺｈｅｎｇ２１ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＳｃｈｏｏｌｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ烄烌ａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉ′ａｎＪｉａｏｔｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ′ａｎ，Ｓｈａａｎｘｉ７１００４９，Ｃｈｉｎａ２ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＭａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇＳｙｓｔｅｍＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＳｃｈｏｏｌｏｆＭｅｃｈａｎｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，烆Ｘｉ′ａｎＪｉａｏｔｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ′ａｎ，Ｓｈａａｎｘｉ７１００４９，Ｃｈｉｎａ烎ＡｂｓｔｒａｃｔＯｐｔｉｃａｌｄｅｓｉｇｎｆｏｒｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｉｓｔｈｅｃｏｒｅｐａｒｔｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｘｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）ｓｙｓｔｅｍ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｓｙｓｔｅｍｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｆｏｒｅｘｃｉｔａｔｉｏｎｕｎｉｆｏｒｍ，ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｔｉｍｅａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ａｎｏｐｔｉｃａｌｓｙｓｔｅｍｉｓｐｒｅｓｅｎｔｅｄ，ｗｈｉｃｈｉｓｂａｓｅｄｏｎｍａｇｎｅｔｏ－ｏｐｔｉｃａｌｓｗｉｔｃｈａｎｄｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒｔｕｂｅ（ＰＭＴ） ｄｅｔｅｃｔｏｒ．ＦｏｕｒＬＥＤｓｅｘｃｉｔａｔｉｏｎｕｎｉｔａｎｄＰＭＴｄｅｔｅｃｔｉｏｎｕｎｉｔａｒｅａｄｏｐｔｅｄｔｏｉｍｐｒｏｖｅｓｙｓｔｅｍｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｏｐｔｉｃａｌｓｗｉｔｃｈｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｔｈｅｏｎｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｓｃａｎｎｉｎｇｍｅｃｈａｎｉｓｍａｎｄｆｉｌｔｅｒｔｏｉｍｐｌｅｍｅｎｔｆｏｕｒ－ｃｏｌｏｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｃａｎｎｉｎｇｏｎａ９６－ｗｅｌｌｓｔａｎｄａｒｄＰＣＲｐｌａｔｅ．Ｔｈｅｄｅｓｉｇｎａｖｏｉｄｓｔｈｅｃｒｏｓｓｔａｌｋａｍｏｎｇｔｈｅｆｏｕｒｃｏｌｏｒｏｐｔｉｃａｌｐａｔｈｓ．Ｗｈｅｒｅａｓｔｈｅｃｒｏｓｓｔａｌｋｇｅｎｅｒａｔｅｄｂｙｔｈｅｓｐｅｃｔｒａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｔｈｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｄｙｅｉｔｓｅｌｆｃａｎｂｅｅｓｔｉｍａｔｅｄｂｙｓｔａｎｄａｒｄｉｔｅｒａｔｉｖｅｆｏｕｒ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓａｌｇｏｒｉｔｈｍ．Ｗｅｆｉｎａｌｌｙｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｓｐｅｃｔｒａｃｒｏｓｓｔａｌｋｂｙｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｓｔｕｄｙｏｆｆｏｕｒｃｏｍｍｏｎｌｙｕｓｅｄｄｙｅｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ；ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ；ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎ；ｓｐｅｃｔｒａｃｒｏｓｓｔａｌｋｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ；ｍａｇｎｅｔｏ－ｏｐｔｉｃａｌｓｗｉｔｃｈＯＣＩＳｃｏｄｅｓ１７０．３８８０；１７０．６２８０；１２０．１８８０；１２０．４５７０收稿日期：２０１３－０７－１２；收到修改稿日期：２０１３－０９－１３基金项目：国家重大科学仪器设备开发专项（２０１２ＹＱ０３０２６１）、