五DNA的复制.pptVIP

第八节 真核生物DNA的复制 一、概况 在真核生物细胞的细胞周期中，DNA的复制发生在间期的S期。 真核生物染色体上DNA的复制是通过许多独立的复制子来完成的，其中只有一部分复制子在S期的任何时间都参与复制，而其他复制子只在S期的特定时间活化。 每个复制子都有固定的复制起点，常常采取双向复制方式。 与原核生物不同，真核生物的复制子相对较小，而且它们的复制叉移动的速度比原核生物复制叉的移动要慢许多。 原核生物的基因组只有一个复制子，而真核生物的染色体含有许多复制起点，是多复制子（multireplicon）。 有证据表明，真核生物染色体的复制子中没有复制终止，复制叉从其起点连续移动直到遇到邻近复制子的复制叉时终止复制。 在一个细胞周期中，染色体上所有的复制子都起始复制，尽管它们不是同时活化的，但都是在一个周期内被激活的，而且每个复制子在一个细胞周期只能被激活一次。 大肠杆菌的复制起点oriC中包含有11个GATC序列，其中腺嘌呤A的第六位N原子N6是Dam甲基化酶（Dam methylase）的作用靶点。 复制前，复制起点oriC两条链上靶位点的腺嘌呤全部是甲基化的，复制事件导致Dam甲基化酶的靶位点由全甲基化（fully methylated）状态转变为半甲基化（hemimethylated）状态。 依赖oriC复制的甲基化质粒在Dam甲基化酶缺陷的（ dam－ ）大肠杆菌中只能复制一次，而后出现半甲基化产物的累积，说明半甲基化的复制起点不能起始新一轮的DNA复制。 所以只有当Dam甲基化酶将半甲基化的复制起点转变为全甲基化状态以后，才可以起始DNA的复制。 一般情况下，复制结束以后复制起点的半甲基化状态要维持13分钟左右，而基因组其他部位的GATC甲基化只需1.5分钟左右。 dnaA基因的启动子也表现出类似的甲基化延迟现象。 在半甲基化阶段，复制起点是无活性的（ inert ），而且dnaA的表达也受到抑制，DNA复制的起始蛋白的产量很低。 已经确定，SeqA基因的突变可以缩短oriC和dnaA再甲基化所需要的时间。SeqA与半甲基化状态DNA的结合力比与全甲基化DNA结合力更强。 在体外，大肠杆菌DNA复制起点的半甲基化状态是复制起点与质膜结合所必需的。复制起点与质膜的结合可能会阻止复制起点过早地（prematurely）再度起始DNA的复制。 已发现一种膜组分特异地识别半甲基化的DNA并阻止DnaA对复制起点的结合。 DNA再度甲基化以后，膜抑制物得到释放，DnaA即可起始DNA的复制过程。 控制DNA复制重新起始的机制还不是完全清楚，可能会包括以下几种情况： 复制起点的物理隔离 再甲基化的延迟 DnaA对复制起点的结合 dnaA基因转录的抑制 真核生物的基因组是由许多复制子（replicon）组成的，每个复制子的复制起点在一个细胞周期内同样也只能被激活一次。 问题的实质集中在以下两个问题上： 调节系统是如何识别已经发生复制的起点的？ 有哪些蛋白质成分参与了这些调控过程？ 非洲爪蟾的卵细胞已成为研究DNA复制起始的理想模式系统。 爪蟾卵细胞内含有复制DNA所需的全部成分，能复制注入卵细胞核内的外源DNA。 研究表明，细胞核内可能存在一/几种蛋白质，在一个细胞周期内会消耗殆尽。尽管细胞质内有大量的这种蛋白质，但由于核膜的阻挡不能进入细胞核内。核膜破坏以后，这个/些蛋白质才可以进入细胞核，激活复制起点进行下一轮的DNA复制。 酵母DNA复制起始的许可因子（licensing factor）为MCM2,3,5蛋白，在有丝分裂期间进入细胞核。 动物细胞中也发现了MCM2,3,5的类似物。 使许可因子失活的一些蛋白质因子如Ubiquitin家族的成员的突变会造成许可因子的持续存在，进而形成大量的DNA累积。说明许可因子在复制周期开始以后便被灭活。 二、DNA聚合酶 与真核细胞中多起点复制相应的特点是细胞中DNA聚合酶的数目众多。一个典型的动物细胞中含有20,000～60,000分子的聚合酶α。 在哺乳动物细胞抽提物中发现了五种不同的DNA聚合酶，它们是α、β、ε、?、?。 其中α(起始)、β (修复) 、ε (增殖，复制) 、? (延伸)位于细胞核中，而? (复制)是线粒体酶。 目前认为，DNA聚合酶α的功能是起始复制，而DNA聚合酶?的功能是延伸两条链。前导链和滞后链合成的起始具有相同的程序。 但还不清楚前导链和滞后链合成的起始是否由同一个DNA聚合酶α/引发酶复合物完成的。 DNA聚合酶β的作用是碱基切除修复，而DNA聚合酶γ是线粒体DNA的复制酶。 最近研究发现，DNA聚合酶ε催化亚基的表达与人细胞增殖紧密联系，表明它在细胞DNA复制中也起关键作用。此外DNA聚合酶ε也可能参与修复反应。 DNA聚合酶?的进行性由PCNA