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应用凯氏定氮法测定蛋白质的原理及其具体的消化、蒸馏 摘要：本文主要针对应用凯氏定氮法测定蛋白质的原理及其具体的消化、蒸馏和滴定过程中的各 个细节及其相应的注意事项进行总结，为从事蛋白质测定工作的检测人员提供参考和帮助。 　　关键词：蛋白质 测定原理 注意事项 　　the experimental summary of kjeldahl nitrogen determination methods 　　zhangguozhi jinan hanon instruments co., ltd 　　abstracts: this article mainly aimed at mirco-kjeldahl determination methods and the digestion, distillation and titration process. summarized the experimental details and their corresponding notes.for the inspection staff in such work provides reference and help. 　　key word: protein, nitrogen determination, notes 　　以凯氏定氮法测定氮含量换算蛋白质的方法，是国际上通用的标准方法，操作简单，测定结果重复性和重现性都很好， 广泛用于各种食品、谷物、饲料等样品的蛋白质含量测定。此法又分为常量、半微量、微量法三种。国家标准规定为半微量凯氏定氮法。其测定原理相同，主要区别 在于常量法的样品及试剂用量较微量法多。而微量法则具有实验规模小，实验费用低的优点。但微量法的准确度和精密度比常量法要差一些。凯氏定氮法整个测定过 程分为消解、蒸馏、滴定三步。 　　要使测定结果有更好的正确度、准确度和精准度，认真细致掌握测定的每个步骤、各个细节及相应的注意事项，就显得 尤为重要。本文就此进行深入的探讨。 　　二、实验过程操作 　　1、主要试剂的配制 　　40%氢氧化钠：化学纯 400g氢氧化钠溶于1000ml无氨蒸馏水中。 　　2%硼酸：纯 20g硼酸溶于1000ml无氨蒸馏水中。 　　0.05mol/l盐酸：纯 4.2ml盐酸定容至1000ml，通过无水碳酸钠标定。 　　混合指示剂：把溶解于95%乙醇的0.l%溴甲酚绿溶液5份和溶于95%乙醇的0.l% 　　甲基红溶液1份混合而成. 　　2、实验过程注意事项 　　(1) 样品应是均匀的。固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。 　　固体样品一般取样范围为0.20g~2.00g;半固体试样一般取样范围为2.00g~5.00g;液体样品取 样10.0ml~25.0ml(约相当氮30mg~40mg)。若检测液体样品，结果以g/100ml表示。 　　样品应是均匀的。固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。 　　(2) 样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上。万一沾附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低，或者用滤纸包裹好一起投入消化，滤纸影响通过空白扣除。消 化时应注意旋转凯氏烧瓶，将附在瓶壁上的碳粒冲下，对样品彻底消化。若样品不易消化至澄清透明，可将凯氏烧瓶中溶液冷却，加入数滴过氧化氢后，再继续加热 消化至完全。 　　(3)消化时，不要用强火。若样品含糖高或含脂及较多时，注意控制加热温度，以免大量泡沫喷出凯氏烧瓶，造成样 品损失。可加入少量辛醇或液体石蜡，或硅消泡剂减少泡沫产生。在整个消化过程中保持和缓的沸腾，使火力集中在凯氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存 在的情况下，使氮有损失。海能公司消解炉sh220或sh520能够很好的解决此问题。 　　(4)如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这样会形成硫酸氢钾，而不与氨作用。因此，当硫酸过多的被消耗 或样品中脂肪含量过高时，要增加硫酸的量;加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点;催化剂硫酸铜在有机物全部消化后，溶液显清澈透明的蓝绿色，可用它来指示消 化终点。此外，硫酸铜还可用做下一步蒸馏时碱性反应的指示剂。 过氧化氢，为氧化剂，有助于有机物消化，同时可以消除消化过程中的气泡现象。 　　(5)向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀物，这是由于分解促进碱与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加 热后又分解生成氧化铜的沉淀。有时铜离子与氨作用，生成深兰色的结合物[cu(nh3)4]2+ ， 加入氢氧化钠是否足量,常常影响整个测定的顺利进行。由反应原理可知，当氢氧化钠足量时有黑色氧化铜生成而使溶液呈淡黑色;当氢氧化钠量不足时就无黑色氧 化铜产生而使溶液呈淡蓝色，所以有无氧化铜颜色存在是判断氢氧化钠是否足量的标志。 　　(6)因蒸馏时反应室的压力