LDH的测定.ppt

乳酸脱氢酶的测定 概述：乳酸脱氢酶是一种氧化还原酶，其辅酶为NAD＋，为糖酵解的关键酶，广泛分布于人体及动物的各种组织内。人体以肾、心及骨骼最为丰富，其次是肝、脾、胰及肺组织内较多。红细胞中LDH较血清高100倍，溶血标本不宜测定LDH。 它以辅酶1为辅酶，催化乳酸和丙酮酸之间的可逆性氧化还原反应。反应的平衡点明显地倾向乳酸的生成，即倾向于丙酮酸的还原，此时的最适PH为7.4-7.8，只需较低浓度的底物，（1.2mmol/L丙酮酸，0.15mmol/L的NADH），即至最适反应浓度，而进行乳酸氧化反应时，最适PH为8.8-9.8，因碱性条件可不断移去反应生成的H＋，以利反应NADH方向进行。并且此时底物浓度需加大至30倍以上，（50mmol/L乳酸，5mmol/LNAD＋）才至最适浓度。LDH只L-A型羟酸有作用，但对D构型的底物无效，LDH由四个亚基组成，M和H两类亚基可聚合成纯四聚体或杂四聚体，形成5种同工酶。LDH受重金属、EDTA和草酸盐的抑制，故EDTA或草酸抗凝血浆也不宜作LDH测定。过量的丙酮酸或乳酸也可抑制LDH，尤对B亚基的抑制更明显。 乳酸＋NAD＋――丙酮酸＋NADH＋H＋（正向L-P，逆向P－L）。 比色法原理：正向反应生成的丙酮酸与溶于酸的2，4二硝基苯肼作用生成丙酮酸－二硝基苯腙，后者在酸性环境中呈草黄色，在碱性溶液中显棕红色，颜色的深浅与丙酮酸的浓度成正比，与标准浓度的丙酮酸生成的苯腙进行比色，可推算LDH的活力。 本法规定37度15分钟产生1umol丙酮酸的酶活力为一个单位， 操作步骤： 1，校正曲线的制作　按表操作 加入物(ml) B 1 2 3 4 5 丙酮酸标准液 0 0.025 0.05 0.1 0.15 0.2 底物缓冲液 0.5 0.475 0.45 0.4 0.35 0.3 去离子水 0.11 0.11 0.11 0.11 0.11 0.11 二硝基苯肼 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 37度水浴15分钟 NaOH 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 相当于金氏单位0 125 250 500 750 1000 室温放置5min后，于440nm波长处比色，比色杯光径为1.0cm，用B管调零，读取各管吸光度。以吸光度值为纵坐标，相应的酶活性单位为横坐标绘制校正曲线。 2，酶活性的测定 加入物(ml) 测定管 对照管 血清 0.01 0.01 NAD＋底物缓冲液 0.5 0.5 37度水浴5min NAD＋溶液 0.1 － 37度水浴15min 2,4二硝基苯肼 0.5 0.5 NAD＋溶液 － 0.1 37度水浴15分钟 0.4mol/L溶液 5.0 5.0 混匀，室温放置5min后，于440nm波长处比色，比色杯光径为1.0cm，用蒸馏水调零，读取各管吸光度。以测定管与对照管吸光度之差值查校正曲线，得酶活性。 单位定义：以100ml血清，37度，作用底物15min，产生1umol丙酮酸为一个金氏单位。 参考范围：190-437金氏单位 注意事项： 1．乳酸锂、乳酸钾、乳酸钠都可以作为LD的底物，但后两种为水溶液，若保存不当容易产生酮酸类物质从而抑制酶促反应，且含量不够准确，目前少用，而乳酸锂为固体，稳定，易称重。 2．除用二乙醇胺缓液外，还可用TRIS或焦磷酸缓冲液。而甘氨酸对LD有抑制作用，故不采用甘氨酸缓冲液。 3．标本严禁溶血，也不采用草酸盐，EDTA抗凝血浆。由于LD4，LD5对冷不稳定，不应贮存于冰箱中，血清标本室温可存放2-3天。 4．比色应在5-15分钟内完成，否则吸光度值会降低。 评价： LD活性测定多采用乳酸生成丙酮酸的反应方向，但反应开始的转化速率是不成线性的，反应速率与温度有关，温度越高，速度越快。以丙酮酸作为底物测定的酶活性所得结果不精确。 * *