生物酶工程 -3.pptVIP

基因突变的方法 基因随机突变 基因重组 定向进化的应用 提高酶分子的PH稳定性实例： Tao等通过DNA改组的方式提高了木聚糖酶的热和碱性PH稳定性。他们在碱性缓冲液中筛选得到具有热稳定性的阳性克隆子，经过三轮DNA改组实验，最终获得最佳突变株表现出显著的热稳定性，在70℃可稳定存在360min,而野生型仅3min就失去50%的活性。 随机片段交换（非同源基因重组） ①用常规PCR扩增待突变基因 ②DNase I消化，获得一系列大小在100-300bp之间的DNA碎片 ③末端脱氧转移酶（TdT）作用，DNA碎片的3′-末端被随意加上一至几个碱基 ④ 以3′-尾巴的短片段互为引物，在无校正活性的DNA聚合酶催化下进行PCR，重新组装 ⑤加入两端引物，扩增出全基因 突变基因文库的构建与分析 A.基因文库的质量 B.文库筛选可选择的方法 A.λ –噬菌体载体系统 B.质粒载体系统 在固体平板培养基中加入底物，根据宿主菌表达的突变酶作用于底物形成透明圈或其它特征进行筛选，通过宿主菌的生长与不生长、培养基颜色变化、特定反应的出现等，判断是否具有目的基因 （1）噬菌体表面展示技术（2）细胞表面展示技术 （3）核糖体表面展示技术（4）mRNA表面展示技术 根据酶与底物作用后产生的荧光基团使其显色后的产物，通过测定荧光信号或在特定波长下的吸收值来筛选突变体。 将细胞荧光染色，通过高速流动系统，排成单行的细胞逐个流经检测区进行测定。 表面展示技术 4 突变基因文库的筛选方法 噬菌体表面展示技术 将编码外源肽或抗体的可变区DNA片段整合到噬菌体的基因组中，以融合形式与噬菌体的表面蛋白共同表达于噬菌体表面，经过吸附-洗脱-扩增过程来筛选，富集外源基因的表达产物，之后进行各种活性与抗性筛选，通过表达产物的性质，筛选出所需要的目的基因。 细胞表面展示技术 将目的蛋白基因与细胞表面结构蛋白基因融合，使目的蛋白活性表达并将表达锚定于细胞表面的一项技术。该项技术主要用于研究细胞表面结构、细胞表面蛋白的识别和相互作用。 核糖体表面展示技术 ①没有终止子的mRNA链 ②翻译mRNA形成蛋白质-核糖体-mRNA复合物（PRM） ③利用与固相上相应配体结合性筛选PRM ④EDTA处理筛选到的PRM使mRNA从核糖体上解离 ⑤RT-PCR扩增目标mRNA，进入下一轮循环 mRNA表面展示技术 用于啤酒酿造，可以有效分解麦芽汁中的木聚糖和戊聚糖，降低麦芽汁中的粘度，改善其过滤性能，防止非碳水化合物混浊的产生 定向进化的应用 酶 性质 突变方法 对硝基苯酯酶 底物专一性 易错PCR 胸腺嘧啶核苷激酶 底物专一性 盒式诱变 β-半乳糖苷酶 底物专一性 DNA改组 绿色荧光蛋白 荧光 DNA改组 核酶 底物专一性 易错PCR 药物和疫苗 活性/专一性 DNA改组 β-葡糖苷酶耐热性的提高 LOGO LOGO LOGO LOGO LOGO LOGO LOGO LOGO LOGO LOGO LOGO 生物酶工程 — 酶的定向进化 吕玲 黄鹏晓 1.酶分子定向进化的历史 2.分子定向进化的基本理论 3.酶分子定向进化策略 4.定向进化的应用 主要内容 1.酶分子定向进化的历史 1993年,美国科学家Arnold F H首先提出酶分子的定向进化的概念,并用于天然酶的改造或构建新的非天然酶. 1994年Stemmer等人首次利用基因重组技术获得了理想的突变体，开拓了酶分子定向进化的方法。 2006年, Ryota等为基因片段重组这一思想增添了新的内容,开发出一新的突变文库构建方法———随机片段交换法该方法主要由三个步骤组成,即基因破碎;添加随机短序列; 重新组装 酶分子的定向进化属于蛋白质的非合理设计，是在实验室试管中模拟达尔文的生物进化过程，人为创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），在体外改造酶的基因并定向选择（或筛选），让目标酶分子在事先设计的道路上快速进化，从而获得预期性质的非天然酶。 2.酶分子定向进化的基本理论 优点：与传统的定点突变等理性设计相比，酶的定向进化不用事先了解酶的结构、活性位点、催化机制等各类因素，只需人为控制进化条件，经定向筛选获得具有特定性质的非天然酶。 总体思路 简言之： 定向进化=随机突变+正向重组+选择