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荧光定量教程 用于检测细胞基因转录水平的实时定量 PCR的操作流程（Real Time Quantitative PCR Protocol For Detection of Gene Expression）第一部分原理 real time PCR是普通 PCR的一项改进，使用了针对扩增 DNA的荧光物质，使得 DNA的数量与检测到的荧光强度成线性关系，大致得到 DNA的扩增曲线（如，图一）。图一：引自美国应用生物系统中国公司网站——实时荧光定量 PCR ——一种科学准确的定量方法。名词解释： Rn:一个反应管经 n次热循环后，测得的荧光强度。 Rn+:反应管含有模板 DNA。 Rn-:反应管含有模板 DNA。无模板对照：No template control，Rn-，理想情况下，是一条平线，只具有背景荧光数值。 Threshold: 荧光（Rn）超过本底时的临界数值。 Ct: threshold cycle，临界循环数， threshold 横线与扩增曲线相交，所得交点所对应的循环数。基线：baseline, 是背景曲线的一段，范围——从反应开始不久荧光值开始变得稳定，直到所有反应管的荧光都将要，但是还未，超出背景。仪器：热循环仪器（ GeneAmp Thermal Cycler 9600）+电脑（装有 Sequence Detection System软件）+荧光检测系统(GeneAmp Sequence Detector 5700)（如，图二）。图二，引自 /。全部实验包括步骤： 1，类似普通 PCR反应的物品混合于反应管，之外还要添加荧光物质（SYBR染料或 TaqMan探针）。 2，使用 SDS软件标明热循环仪器中放入的所有反应管，设定热循环仪器的温度变化，存储热循环仪器的工作情况，存储荧光信号，分析 DNA的扩增曲线。 3，利用 SDS输出的数据，其他专业数据处理软件，近似计算得到原始 DNA的浓度，做必要的误差分析。 SYBR 是一种结合于所有 dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。 TaqMan探针是由产荧光基团，荧光淬灭基团，与扩增子有互补的核苷酸序列组成。 GeneAmp 5700 Sequence Detector 总是在 PCR循环的退火 /延伸时间段依次收集反应馆的激发荧光强度。Real time PCR 与普通 PCR的细节上的区别还有：使用持家基因作内部参比（ endogenous control/reference，是同一种 cDNA中的比较，并不是同一反应管中作比较的意思）；推荐使用 ROX(具有红色激发波长的染料)来抵消荧光背景（本底）；用浓度（比较）确定的 DNA来做出标准曲线（Ct——log原始模板/DNA浓度）。具体情况将在操作流程中讲述。本次实验的具体目的：测出 PTX, LPS刺激不同时间后，DC的基因转录变化，属于 “relative quantitation (相对定量)”。这个结果可以拿来与以前所做的 cDNA Microarray 结果（半定量）作比较，确认或修正之。第二部分操作流程一仪器，用品，试剂 GeneAmp Thermal Cycler 9600 GeneAmp Sequence Detector 5700 电脑 Sequence Detection System软件数据处理软件（如，Excel）引物设计软件光学管子，optical tube and cap + 架子微量移液器（枪）+ 枪头（tip）离心机 + 螺旋振荡器冰箱冰盒一次性手套琼脂糖凝胶电泳相关试剂二前期准备细胞按要求培养，抽 RNA, 反转录为 cDNA。有细胞计数，测 RNA浓度（分光光度计）等环节。选择反应物，待测样本：0hr, P4, L4, P12, L12, P24, L24, P36, L36 九种阴性对照：即无模板对照， NTC 作为标准的样品：如果有必要做标准曲线的话，选择一种比较容易准确定量的 DNA (如果是进行绝对定量分析，则需要浓度完全已知的 DNA标准品——要求：能够被引物所扩增，比如，其他种类细胞的 cDNA, 或，克隆有 DNA片段的质粒载体)。选择引物（基因） endogenous control 使用的持家基因：GAPDH(甘油醛脱氢酶)，HPRT（为什么使用之？……）转录水平待测的基因因为每个反应管要做 3次重复以上，所以应该准备好充足量的 PCR试剂，推荐——先混合得到 Master Mix, 再分至各个反应管。三流程 1 标准曲线2 待测 cDNA的 PCR扩增 ※标准曲线和待测样品其实应该在同一次 real time PCR中做。第一次做的话，试验的成分更多些，所以，重复数应该大一些（