家蚕论文：Bmo-let-7在家蚕化蛹过程中的功能研究.docVIP

家蚕论文：Bmo-let-7在家蚕化蛹过程中的功能研究 【中文摘要】昆虫是种类最丰富的种群,与人类生产、生活密切相关。昆虫的发育是昆虫研究中的重要研究领域。昆虫分为不完全变态昆虫和完全变态昆虫。完全变态昆虫的外形和生理特点在生命周期各个阶段都有很大差异。家蚕是完全变态昆虫,一生经历卵、幼虫、蛹和成虫四个阶段。这些不同阶段的时序发育机制还不清楚。作为重要的经济昆虫和鳞翅模式生物,对家蚕发育调控的研究在蚕桑产业和鳞翅目害虫防治方面都有着十分重要的意义。Let-7是首先发现的microRNAs之一,在线虫、果蝇、斑马鱼、人类等许多物种中都高度保守。家蚕中首先被实验验证的microRNA也是let-7。Let-7在家蚕中的表达与在其他物种中的表达模式类似,都高量表达于个体发育后期。本文着重探究了let-7是否调控家蚕幼虫到蛹的发育过程,并对其靶基因进行了实验验证。Let-7表达量改变后,家蚕的化蛹过程受到影响。Let-7表达量提高后家蚕化蛹过程受到抑制。Let-7具有抑制细胞分裂,促进分化和成熟的作用；而Ras激活突变会导致细胞的分裂更加旺盛。Let-7有可能是通过抑制Ras来发挥其功能。1.改变let-7表达量对家蚕化蛹的影响家蚕从幼虫到蛹的转变要经历一个过渡时期,即预蛹期。在预蛹期上调let-7将阻碍家蚕化蛹,而一定程度下调并不影响家蚕化蛹。阴性对照、突变let-7的种子碱基都不会影响家蚕化蛹。综合以上实验证明是let-7上调导致家蚕不能化蛹。2.检测let-7及Ras mRNA表达Let-7 mimics能够上调let-7,而let-7antagomir能够下调let-7。let-7上调水平随let-7mimics剂量提高而上升。Let-7表达变化并不明显改变Ras的转录水平。3.检测Ras蛋白丰度克隆Ras基因编码区,原核表达,纯化后制备多克隆抗体。改变Let-7表达量后检测Ras蛋白的表达,发现let-7上调后Ras2和Ras3蛋白含量有所降低,Ras1蛋白含量没有明显变化。由此表明Ras2和Ras3可能是let-7的靶基因。4.验证Ras 3,UTR的let-7结合位点MicroRNAs调控靶基因可以通过两种方式：直接结合靶位点或通过其他基因间接调控靶基因。MicroRNAs通常是与靶基因3’UTR上的靶位点相结合来调控靶基因表达。通过预测发现let-7在Ras1、Ras2和Ras3的3’UTR上分别有2个、2个利5个结合位点。连订Ras23’UTR的荧光素酶报告基因与let-7 mimics共转染细胞,其荧光素酶活性降低,证明Ras23’UTR有let-7的结合位点。 【英文摘要】Isecta are the most diverse classes of animals and are closely related to humans. Insects are classified to be holometabolous and hemimetabolous. Like other holometabolous insects, silkworm undergo egg, larva, pupa and adult stages, however, the mechanisms underlying the stage transferring is still not determined. As an important economic insect and characteristic model of Lepidoptera, silkworm has important position in in sericulture industry and Lepidoptera Pest control.Let-7 is one of the two founding members of microRNAs. It is highly conserved across species. Bmo-let-7 is the first microRNA experimently identified in the silkworm. It is especially highly expressed in the late stages of life cycle in many species. This thesis will focus on the involvement of let-7 in the pupation of silkworm.Silkworm pupation is hindered if let-7 expression is increased. Let-7 promotes d