2015春 第四章 酶的分离纯化.pptVIP

* ⑴ 选柱 层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要求来进行选择。一般来讲，层析柱的长度对分辨率影响较大，长的层析柱分辨率要比短的高；但层析柱长度不能过长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等现象。一般柱长度不超过100cm，为得到高分辨率，可以将柱子串联使用。层析柱的直径和长度比一般在1:25－1:100之间。 ⑵ 装柱 除了购买预装柱（比如：高效液相层析柱）以外，常规层析柱需要自己填充。而柱子填充质量的好与差，是关系到柱层析法能否成功分离纯化物质的关键。 一般要求填料在柱内颗粒大小分布均匀，松紧一致，填料微孔中无气泡，不能分层，连接处无死体积，柱床体积稳定，在较高的工作压力下不坍塌变形、流速稳定等。否则要重新装柱。 在填充层析柱之前，对所要填充的材料需作一些预处理。可根据不同的材料作相应的溶胀、漂洗、再生、转型、脱气等。例如，将层析用的基质（如吸附剂、树脂、凝胶等）在适当的溶剂或缓冲液中溶胀，并用适当浓度的酸（0.5N～1N）、碱（0.5N～1N）、盐（0.5M～1M）溶液洗涤处理，以除去其表面可能吸附的杂质，用去离子水（或蒸馏水）洗涤干净，然后再用酸碱处理得到所需的离子形式，最后再用去离子水（或蒸馏水）洗涤至中性。 层析柱的填充是先关闭出水口，用溶剂灌注至1/3柱高，并使筛板下的“死体积”不存有气泡，再将处理好的填充材料缓慢地倒入柱中，以防止气泡存留在柱内，静置使其沉降