03_动物基因工程基础.ppt

4、逆转录PCR（retrotranscription PCR,RT-PCR） 以RNA为模板，经逆转录获得与RNA互补的DNA链即cDNA,然后以cDNA链为模板进行的PCR反应。 帽子 AAAAA mRNA 3‘ 5’ TTTTT 以其为模板进行PCR扩增 逆转录 合成cDNA互补链并退火 寡聚dT引物 优点： 是检测RNA分子的良好方法，也是获取测序用模板DNA的有效手段，同时还是克隆mRNA之cDNA的重要步骤 RT-PCR具有很高的敏感性,可以用来分析不同组织或是相同组织不同发育阶段中mRNA表达状况的相关性 可以用来研究低表达活性基因的mRNA生理变化动态 判断 根据琼脂糖凝胶电泳中样品条带的强度比较，便能确定两种PCR反应产物之间的数量关系 前提条件 所测定的mRNA分子必须来自由一个或数个间隔子的基因 5、锚定PCR 特别适合预扩增那些只知道一段序列的目的DNA 对于一端序列已知，一端序列未知的DNA片段，可以通过DNA末端转移酶给未知序列的那一端加上一段多聚dG的尾巴，然后用多聚dC和已知序列作为引物进行PCR扩增 5’ 3’ DNA序列 GGGGG 3’ 5’ 3’GGGGG 5’ GGGGG 3’ 5’ 3’GGGGG 5’ 锚定引物 CCCCC（多聚dC引物） 进行PCR扩增 5’ GGGGG 3’ CCCCC 加多聚dG尾巴 加入引物 已知序列 扩出的未知序列 6、反向PCR 特别适合用于扩增已知序列两端的未知序列 方法：选择一个在已知序列中没有，而在其两侧都存在的限制性内切酶位点，用相应的限制性内切酶酶解后，将酶切的片段在连接酶的作用下环化，使得已知序列位于环状分子上，根据已知序列的两端序列设计两个引物，以环状分子为模板进行PCR，就可以扩增出已知序列两侧的未知序列。 5’ 3’ L R 酶切位点 酶切位点 L R 已知序列 限制性内切酶酶解 环化 RE a b a d c d c 直接测序或克隆后再测序 五、外源基因在宿主细胞中的高效表达 有效的转录起始 外源基因能否在宿主细胞中高效表达的关键步骤之一 选择强的可调控的启动子及相关的调控序列 在发酵的早期阶段表达载体的启动子被紧紧地阻碍，可避免出现表达载体不稳定，细胞生长缓慢或由于产物表达而引起细胞死亡问题 当细胞数目达到一定的密度，通过各种诱导（温度、药物等）使阻遏物失活，RNA聚合酶快速启动 有效的转录起始 T7噬菌体启动子:T7RNA聚合酶几乎能完整地转录在T7启动子控制下的所有DNA序列 真核细胞的表达载体：启动子、增强子 mRNA的有效延伸和转录终止 转录物内的衰减和非特异性终止可诱发转录中的mRNA分子提前终止 衰减子：负调控元件，尽量避免 非特异性终止：加入抗终止元件 正常的转录终止子 防止不必要的转录，使mRNA的长度限制到最小，增加表达质粒的稳定性 真核细胞 含有转录终止序列和poly(A)加入位点 mRNA的稳定性 mRNA的稳定性直接关系到翻译产物的多少 原核细胞 利用RNase缺失的受体菌 真核细胞 使mRNA 5’端和3’端正确加工，提高成熟mRNA的稳定性 有效的翻译起始 多种成分协同作用的过程，包括mRNA、16sRNA、fMet-tRNA之间的碱基配对 达到最大效率的一般原则 AUG是最首先的起始密码子，GUG、UUG、AUU、AUA有时也用，但非最佳选择 SD序列：至少含有AGGAGG序列中的四个碱基 SD序列与起始密码之间的距离以9±3为适宜 处于起始密码5’端的核苷酸应该是As和Us（－3位置应为A） 如果在起始密码AUG后的序列GCAU或AAAA序列，能使翻译效率提高 翻译起始区周围的序列应不形成明显的二级结构 有效的翻译起始 真核细胞 共有序列5’-CC CCATGG -3’是必需的 －3位应是嘌呤碱基，＋4位是G 在起始密码的上游区存在另一个起始密码，又不被其后的一个符合读框的终止密码所隔断，这个上游起始密码会损害翻译的起始 A G 遗传密码应用的偏倚性 对遗传密码的应用不是随机 对高表达的基因经常使用偏倚性密码 基因编码序列的5’端，使用偏倚密码更能提高表达效率 mRNA的二级结构 破坏mRNA的5’-未翻译区的茎－环结构，增强翻译起始效率 RNA的加工 内含子 包含有增强子或其它顺式调控元件 剪接增加了mRNA在核内的稳定性，导致在细胞质中积累更多成熟的mRNA 含有使染色体功能域开放的序列，可能通过影响核质成分、位置等来提高基因的表达 mRNA序列上终止密码的选择 UAA终止效率最好 一串联的终止密码 表达质粒（或载体）的拷贝数及稳定性 选择高拷贝质粒 通过反式作用因子同复制起点相互作用或通过标记基因加选择压力，使目标基因得以扩增，从而提高基因的表达水平 尽量减少表达载体的大