实验教程-细胞染色.ppt

贴壁细胞或组织 贴壁细胞： 胰蛋白酶消化 离心 PBS重悬 组织： 胰蛋白酶消化或胶原酶处理或研磨法处理 ＰＢＳ洗涤 　离心 　ＰＢＳ重悬 注意：贴壁细胞或组织来源细胞制备时必须过滤（使用尼龙网或２００目以上组织筛）！ 细胞膜染色 加入需要染色的抗体 加入抗凝血100ul或调整好浓度的细胞悬液１００ｕｌ，混匀，室温避光15min-30min 加入红细胞裂解液，混匀室温，5-10min。 加入与红细胞裂解液等量的PBS。混匀，5min 细胞内染色 按细胞膜染色方法染膜表面抗体 加入PBS洗涤 细胞悬液离心后留沉淀 加入固定剂固定A 加入破膜剂B 加入胞内抗体，室温20-30min 加入PBS洗涤 加入PBS重悬 固定剂：乙醇，4% 多聚甲醛，甲醇等 破膜剂：乙醇，tritonX-100，皂素，甲醇等 对于细胞比较少的细胞样品：使用商品化的固定破膜剂！ 评定补偿质量的手段 通过调整在象限荧光点图中与阴性细胞群有关的阳性细胞群的位置来达到. 当补偿正确时, 阳性细胞群应与阴性细胞群处在同一水平或垂直线上. 同一水平时, 阴阳细胞群y坐标的中间值应很接近; 在同一垂直线上时, x坐标的中间值应很接近. 验证: 将单色染色得到的百分数与多色染色得到的百分数相比较, 二值应接近, 如果不一致, 则可能颜色补偿不正确, 或抗体搭配不恰当. 由一株B细胞杂交瘤增生而成的单一克隆细胞所产生的一种高度均一, 高度专一性的抗体.(Monoclonal Antibody, McAb). 1975年, Koehlerz 和Milstein首次应用细胞融合技术将小鼠免疫脾(B)细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合, 形成杂交瘤细胞.这种杂交瘤细胞既保持了骨髓瘤细胞大量无限增生的特性, 又继承了免疫B细胞合成分泌某种特异性抗体的能力. 应用该技术, 即可得到均一化学结构和单一特异性的抗体分子, 成为单克隆抗体, 简称单抗. 每种单抗只识别某一特定的抗原决定簇, 具有高度特异性. 目前生产的单抗以动物源性为主. 单抗种类: 纯净品 荧光抗体(将单抗与不同荧光染料结合) 生物素化抗体(单抗与生物素结合) ? 单克隆抗体 Mouse anti-Human CD3-FITC Clone:UCHT1 Isotype:IgG1 Mouse Mouse: 抗体来源----小鼠 Anti-Human: 检测对象为人类细胞 CD3-FITC: 检测CD3的抗原, 该抗体为FITC荧光素标记 UCHT1: 抗体的Clone 株 IgG1 Mouse: 为抗体的免疫球蛋白亚型,所以选用的阴 性对照应为Mouse IgG1-FITC 如何读懂荧光标记的单克隆抗体 荧光抗体组合的选择和搭配1 用不同颜色的荧光素标记不同种类的单克隆抗体，可以在一个细胞上同时分析多种抗原分子，但并非各种荧光抗体均可以自由地组合在一起，在确定组合选择之前，还必须考虑到一些影响因素 1. 流式细胞仪的类型及荧光光谱 选择适当强度的光源作为荧光物质的激发光源，并选择适合于被检荧光物质选择性吸收的光谱滤光片接收荧光 2. 了解不同抗体的细胞反应谱，以及染色模式 根据不同的实验目的选择抗体。因为相同CD编号的抗体可能识别不同的抗原决定簇。如CD45RA表达在幼稚/静止T淋巴细胞，而CD45RO表达在记忆/活化T淋巴细胞。 胞膜和胞内染色：通常，先胞膜染色，固定，膜通透和胞内染色，最后是DNA染色。 荧光抗体组合的选择和搭配 2 3. 抗体结合荧光素的荧光强度 每一种荧光素的相对荧光强度都不一样。一个特定抗体，能否区分阴性与阳性结果，即有较好的S/N比值，取决于该抗体用何种荧光素标记。 荧光素相对强度也与仪器有关，这是由于不同仪器使用的激光和滤光片组合不同，因此造成了荧光强度的差别。 4. 抗原密度 高表达的抗原几乎可以用任何荧光素标记的抗体检测，而较低表达的抗原（如细胞因子）则需要用较高S/N比值的荧光素（如PE,PE-Cy5,APC）标记的抗体检测，从而达到有效区分阳性细胞群和阴性细胞的目的。 荧光抗体组合的选择和搭配 3 5. 荧光光谱之间的重叠 在多色分析中，虽然可以通过荧光补偿消除荧光光谱重叠的影响，但使用荧光探针的种类越多，补偿的复杂程度增加，因此选择光谱重叠越少的组合越好 6. 自发荧光 每个细胞群体的自发荧光水平都不同，自发荧光在高波长范围里（600nm）迅速降低。因此检测自发荧光水平高的细胞时，使用发射光波长较长的荧光染料（如PE-Cy5/ PE-Cy7），可得到较好