四荧光显微镜LeitingPan.PPT

Introduction to Optical Microscopy 一.背景简介 二.显微镜相关参数 三.显微镜一些成像原理 四.荧光显微镜 五.激光扫描共聚焦显微镜（LSCM) 1590年，荷兰和意大利的眼镜制造者已经造出类似显微镜的放大仪器。 1610年前后，意大利的伽利略和德国的开普勒在研究望远镜的同时，改变物镜和目镜之间的距离，得出合理的显微镜光路结构。 1673～1677年期间，列文胡克制成单组元放大镜式的高倍显微镜。 19世纪，高质量消色差浸液物镜的出现，使显微镜观察微细结构的能力大为提高。 19世纪70年代，德国人阿贝奠定了显微镜成像的古典理论基础。 1850年出现了偏光显微术；1893年出现了干涉显微术；1935年荷兰物理学家泽尔尼克创造了相衬显微术，他为此在1953年获得了诺贝尔物理学奖。 19世纪20年代，恩斯特·鲁斯卡用电子代替光制作了一个显微镜，能够把实物放大17倍，他获得了1986年诺贝尔奖的物理奖，现在可得到百万倍的放大， 倒（正置）置显微镜 体视显微镜 金相显微镜 偏光显微镜 相差显微镜 干涉显微镜 微分干涉对比显微镜（DIC) 倒置（正置）荧光显微镜 数码显微镜 扫描隧道显微镜（STM） 扫描电子显微镜（SEM）（反射） 透射电子显微镜（TEM） 发射式电子显微镜 焦点深度的简称，即在使用显微镜时，当焦点对准某一物体时，不仅位于该点平面上的各点都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度内，也能看得清楚，这个清楚部分的厚度就是焦深。 焦深与物镜的数值孔径及分辨率成反比，物镜低倍到高倍切换再调焦，反之则不用。 观察显微镜时，所看到的明亮的圆形范围叫视场 。 视场直径也称视场宽度，是指在显微镜下看到的圆形视场内所能容纳被检物体的实际范围。视场直径愈大，愈便于观察。 F=FN/β ，F-视场直径，FN-视场数（Field Number），β-物镜放大率。 蔡司视场数是23mm ，用100X的物镜，其视场数是23mm/100＝0.23mm，就是说把一个0.23mm的线段放在显微镜下观察，线段两端正好在视野边缘。 工作距离也叫物距，即指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离。镜检时，被检物体应处在物镜的一倍至二倍焦距之间。因此，它与焦距是两个概念，平时习惯所说的调焦，实际上是调节工作距离。 显微镜的光学系统也包括盖玻片在内。由于盖玻片的厚度不标准，光线从盖玻片进入空气产生折射后的光路发生了改变，从而产生了相差，这就是覆盖差。覆盖差的产生影响了显微镜的成响质量。 数值孔径越大的物镜，工具距离越短，对盖玻片厚度有一定的要求。国际上规定，盖玻片的标准厚度为0.17mm，许可范围在0.16-0.18mm，在物镜的制造上已将此厚度范围的相差计算在内。物镜外壳上标的0.17，即表明该物镜所要求的盖玻片的厚度。 1.消色差物镜（Achromatic objective）：校正了轴 上红，蓝二色点的位置色差、黄绿光球差。 2.复消色差物镜（Apochromatic objective）：校正 红、绿、蓝三色光的色差，校正红、蓝两色光的球差。 3.半复消色差物镜（Semi apochromatic objective）校正红、蓝两色光的球差和色差。 4.平视场物镜（Plan objective ）：视场平坦，校正场曲的缺陷，提高视场边缘成像质量的目的。 5. 单色物镜：紫外物镜 6. 特种物镜：相衬物镜，长工作距离物镜。 1.色差（Chromatic aberration):光的波长不同 ，所以在通过透镜时的折射率也不同，这样物方一个点，在像方则可能形成一个色斑。光学系统最主要的功能就是消色差.单色光不产生色差。 2.球差(Spherical aberration)：球差是轴上点的单色相差，是由于透镜的球形表面造成的。球差造成的结果是，一个点成像后，不再是个亮点，而是一个中间亮边缘逐渐模糊的亮斑，从而影响成像质量。 3.慧差(Coma)：慧差属轴外点的单色像差。轴外物点以大孔径光束成像时，发出的光束通过透镜后，不再相交一点，则光点的像便会得到如豆点状，型如慧星，故称“慧差”。 4.像散（Astigmatism）：像散也是影响清晰度的轴外点单色像差。当视场很大时，边缘上的物点离光轴远，光束倾斜大，经透镜后则引起像散。象散使原来的物点在成象后变成两个分离并且相互垂直的短线。 5.场曲（Curvature of field）：场曲又称“像场弯曲”。当透镜存在场曲时，整个光束的交点不与理想像点重合，虽然在每个特定点都能得到清晰的像点，但整个像平面则是一个曲面。 6.畸变（Distortion）除场曲外，都影响象的清晰度。畸变是另一种性质的相差，光束的同心性不受到破坏。因此，不