微生物的培养方式和纯培养分离法5微生物的培养方式和纯培养.DOC

微生物的培养方式和纯培养分离法5 ? 三、微生物的培养方式和纯培养分离法 （一）微生物的培养方式 1．分批培养（batchculture）将微生物置于一定容积的培养基中，经培养，最后一次收获，谓分批培养。在分批培养中，培养基一次加入，不予补充，不再更换。由于营养消耗，代谢产物积累，对数生长期不能长期维持。 2．连续培养（continuous culture）在培养器中不断补充新鲜营养物质，并不断排出部分培养物（包括菌体和代谢产物），以保持长时间生长状态的一种培养方式。主要有恒浊连续培养和恒化连续培养两类。恒浊连续培养通过不断调节流速，使培养液浊度保持恒定，因而可不断提供具有一定生理状态的细胞，并可得到以最高生长速率进行生长的培养物。恒化连续培养通过控制恒定的流速使营养物浓度基本恒定，从而使微生物保持恒定的生长速率。用不同浓度的限制性营养物进行恒化培养，可得到不同生长速率的培养物。 3．半连续培养（semi－continuous culture）在发酵罐中的一部分发酵液保留下来作为菌种液，放出其余部分进入提练加工工序，在剩余的培养液中加满新的未接种的培养液，继续培养，如此反复，谓之半连续培养。 4．补料分批培养（fed－batch culture）补料分批培养又称半分批培养，是指在分批培养过程中，间歇或连续地补加新鲜培养液，但不取出培养物。待培养到适当时期，将其从反应器中放出，从中提取目的生成物（菌体或代谢产物）。若放出大部分培养物后，继续进行补料培养，如此反复进行，则称为重复补料分批培养（repeated fed－batch culture）。与传统分批发酵相比，补料分批发酵的优点在于使发酵系统中的基质浓度维持在低水平，这有以下优点：①可除去快速利用碳源的阻遏效应，并维持适当的菌体浓度，以减轻供氧矛盾；②避免有毒代谢物的抑菌作用；③大为减少了无菌操作要求十分严格的接种的次数。与连续发酵相比，补料分批培养不会产生菌种老化和变异等问题。故其应用范围十分广泛。 5．同步培养 能使培养的微生物处于较一致的，生长发育在同一阶段上的培养方法叫同步培养法。利用同步培养法控制细胞的生长，使它们处于同一生长阶段，所有细胞都能同时分裂，这种生长方式叫同步生长（图3—4）。用同步培养法得到的培养物叫同步培养物（synchronous culture）。这样，群体和个体行为一致，即可用研究群体的方法来研究个体水平上的问题。由于同步群体的个体差异，同步生长往往最多维持2个～3个世代，然后又逐步变为随机生长。 （二）微生物纯培养分离法 微生物在自然界中都是混杂地生活在一起，要想研究和利用某种微生物，须把它从混杂的微生物群中分离出来，以得到只含该种微生物的培养物。微生物学中，将在实验室条件下从一个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代称为纯培养（pure culture）。分离纯培养的方法通常有以下几种： 1．稀释法 （1）平皿倾注法 见本节二（二）之1。 （2）平板涂布法 预先制备平板。然后制备并吸取适度稀释的菌液，滴于各平板中央（每皿一滴，约0.05ml），用无菌刮刀将菌液均匀涂布于平板表面。 2．平板划线法 划线的方式很多，其目的都是使平板上菌体逐渐变稀，最终形成单菌落。划线用平板也要预先制备。常用的是以下两种方式： （1）针尖稍弯的接种针火焰灭菌并冷却后，取样；在靠近平皿边缘处的平板上，将针尖的弯曲部位接触平板，接种棒与平板面成30°～40°角，划3条～4条平行线；转动平皿约50°角，灼烧接种针，冷却后，通过前一区划2条～3条平行线，并继续划2条～3条不通过前一区的平行线；再转动平皿……如此划4区～5区（图3—5A）。此种方法适用于分离纯化固体培养基上的培养物。 （2）灼烧并冷却的接种环取样后，在平板上作连续划线（图3—5B）。此适用于液体样品。 3．单细胞挑取法 把一滴菌悬液置于载玻片上，用安装在显微镜挑取器上的极细的毛细吸管，在显微镜下对准某一个单独的细胞吸取，再接种于培养基上培养。此法限于高度专业化的科研。 4．利用选择培养基分离法 （1）采用选择性高的培养基 例如，以纤维素为唯一碳源，分离分解纤维素的微生物；用无氮培养基分离自生固氮菌；在15ml培养基中加25％乳酸1滴～2滴以抑制细菌生长，把受细菌污染的霉菌分离出来。 （2）培养基中加抑制剂 例如，结晶紫10mg/L可抑制G+细菌生长，利于分离G-细菌；KMnO4100mg/L抑制细菌和霉菌生长，利于分离放线菌；制霉菌素50mg/L或放线酮50mg/L利于分离纯化放线菌；分离纯化霉菌或放线菌时，加链霉素30mg/L、金霉素2mg/L可抑制细菌生长。 5．其他 如，高温处理（80℃ 15min或100℃ 10min）分离芽孢杆菌；4％KOH处理痰液，分离结核杆菌等等。 四、环境因素对微生物生长的影