GS和GOGAT酶活性测定.doc

实验报告（修改中勿动） 9月8日 张青 谷氨酰胺合成酶（GS）原理 谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP和Mg2+存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ─谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位μmol·mg﹣1protein·h﹣1。也可间接用540nm处吸光值的大小来表示，单位A·mg﹣1 protein·h﹣1。 【仪器与用具】 冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2ml、1ml）。 【试剂】 提取缓冲液： 0.05mol/L Tris-HCl，pH8.0，内含2mmol/L Mg2+，2mmol/L DTT，0.4mol/L蔗糖。称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）1.5295g，0.1245g MgSO4·7H2O，0.1543g DTT（二硫苏糖醇）和34.25g蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl调至pH8.0，最后定容至250ml； 反应混合液A（0.1mol/L Tris-HCl缓冲，pH7.4）以加入1.6ml反应混合液A的为对照内含80mmol/L Mg2+，20mmol/L谷氨酸钠盐，20mmol/L半胱氨酸和2mmol/L EGTA，称取3.0590g Tris，4.9795 gMgSO4·7H2O, 0.8628g谷氨酸钠盐，0.6057g半胱氨酸，0.1920gEGTA，去离子水溶解后，用0.1mol/L HCl调至pH7.4，定容至250ml； 反应混合液B（含盐酸羟胺，pH7.4）： 反应混合液A的成分再加入80mmol/L 盐酸羟胺，pH7.4； 显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl3和0.6mol/L HCl混合液）： 3.3176g TCA（三氯乙酸），10.1021g FeCl3·6H2O，去离子水溶解后，加5ml浓盐酸，定容至100ml； 40mmol/L ATP溶液：0.1210g ATP溶于5ml去离子水中（临用前配制）。【方法】 　　1.粗酶液提取 称取植物材料于研钵中，加3ml提取缓冲液，置冰浴上研磨匀浆，转移于离心管中，4℃下15,000g离心20min，上清液即为粗酶液。 　　2.反应　1.6ml反应混合液B，加入0.7ml粗酶液和0.7ml ATP溶液，混匀，于37℃下保温半小时，加入显色剂1ml，摇匀并放置片刻后，于5,000g下离心10min，取上清液测定540nm处的吸光值，以加入1.6ml反应混合液A的为对照。 　　3.粗酶液中可溶性蛋白质测定 取粗酶液0.5ml，用水定容至100ml，取ml 用考马斯亮蓝G-250测定可溶性蛋白质（见实验28）。 　　4.原始数据记载 　　5.结果计算： 　　　GS活力(A·mg﹣1 protein·h﹣1)＝ 　　式中 A—540nm处的吸光值； P—粗酶液中可溶性蛋白含量（mg/ml）； V—反应体系中加入的粗酶液体积（ml）； T—反应时间（h）。粗酶液提取同GS。【试剂】 提取缓冲液： 0.05mol/L Tris-HCl，pH8.0，内含2mmol/L Mg2+，2mmol/L DTT，0.4mol/L蔗糖。称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）1.5295g，0.1245g MgSO4·7H2O，0.1543g DTT（二硫苏糖醇）和34.25g蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl调至pH8.0，最后定容至250ml；20 mmol/ L的α-酮戊二酸，10 mmol/ L 的KCl 20mmol/ L的L-谷氨酰胺L-谷氨酰胺 3 mmol/ L NADH（使用之前配置） 5．（需要核查） 25 mmol/L 的Tris - HCl 缓冲液(pH 7.6)三羟甲基氨基甲烷（Tris）0.g，并用PH指示剂以及0.1mol/L盐酸溶液调整PH值至7.6，再定容至250ml】 【方法】1. 粗酶液提取 称取于研钵中，加3ml提取缓冲液，置冰浴上研磨匀浆，转移于离心管中，4下15,000g离心20min，上清液即为粗酶液。0.3 mL酶液0.5 mL 20 mmol/ L的α-酮戊二酸0.1 mL 10 mmol/ L 的KCl0.2 mL 3 mmol/ L NADH，L-谷氨酰胺总体积3.0 mL，不足部分用25 mmol/L 的Tris - HCl 缓冲液(pH 7.6)补足。L-谷氨酰胺Tris-HCl缓冲液（0.0 mol/L）