mRNA差异显示技术的研究进展.doc

 第 19 卷 第 6 期 1 9 9 9 年 11 月 中 国 兽 医 学 报 V o l. 19, N o v. N o. 6 1 9 9 9 C h in e se Jo u rn a l o f V e te r in a ry Sc ien ce 差异显示技术的研究进展 m RNA 梁德勇2 , 崔振中1 , 王晓民1 , 朱丽霞2 , 韩济生1 (11 北京医科大学 神经科学研究所, 北京 100083; 21 中国中医研究院 针灸研究所, 北京 100700) 关键词: m RN A 差异显示; 基因; 神经; 药理学 中图分类号: Q 78 文献标识码: A 文章编号: 100524545 (1999) 0620618204 在高等生物的发育过程中, 基因的表达具有组织特 异性及生长期特异性, 正是由于基因的差异表达决定了 所有的生命过程。 在个体发育调节, 细胞增殖、分化与凋 亡, 生理刺激, 病理变化, 以及某些药物的治疗等都会出 现 m RN A 表达水平的变化。分析不同类型细胞中基因表 达的差异, 并克隆那些对生命过程以及病理变化至关重 要的特异性表达基因, 是分子生物学研究的重要任务。传 统的基因分离方法主要有扣除杂交和差异杂交技术。 虽 然用这些技术已成功分离许多重要的基因, 但技术操作 繁琐, 花费时间长, 重复性差, 效率低, 而且只能进行 2 种 组织样品的比较, 因此在应用中受到了限制。m RN A 差异 M N 随机组合, 理论上可以获得几乎所有 m RN A 的特异 扩增片段。通过测序胶电泳便可显示出清晰的电泳条带。 差异显示 PCR 基本技术方法是利用不同来源的细胞 或不同状态的同种细胞作为研究对象, 分别抽提各自的 总 RN A , 以 T 12M N 作 为 锚 定 引 物 将 m RN A 逆 转 录 成 cDN A , 对逆转录产物采用 5′端的随机引物和 3′端的 T 12 M N 引物以及含有放射性同位素标记的 dN T P 进行 PCR 扩增反应, 所得 PCR 产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳, 然后 作放射自显影, 在 X 光片上显示 100 条左右的条带。对这 些条带进行对比分析, 从中找出差异表达的 cDN A 片段。 从胶上切割下这些特异性表达差异的条带, 用相同的引 物和条件进行 PCR 再扩增, 克隆所得的 PCR 产物并进行 核苷酸序列分析, 将测出的序列与基因序列数据库中的 序列作同源比较, 即可知道分离和克隆到的是已知基因, 还是未知基因。 显示 (m RN A d iffe ren t ia l d isp lay ) 1 PCR ( d iffe ren t ia l d isp lay reve r se 或 差 异 显 示 反 转 录 t ran sc r ip t io n PCR , DD R T 2PCR ) 2 技术的建立, 克服了以往技术的缺陷, 从 而带来了方法学上的突破。 2 模板与反转录反应 1 差异显示技术的原理 m RN A 差异显示技术的第 1 步就是要把 m RN A 逆转录成 cDN A 。以纯m RN A 为模板可减少背景, 对以后的操作最 为有利, 但由于提纯 m RN A 的步骤较繁琐, 回收率不高, 且无 rRN A 保护时m RN A 更易降解, 所以通常用总 RN A 代替 m RN A 。用总 RN A 作模板与 m RN A 作模板的差异 显示结果一致3 。差异显示技术对 RN A 的提取方法没有 严格的要求, 但无论用哪种方法提取的 RN A 或 m RN A 都应是无 DN A 污染的, 而且是完整的, 因为 RN A 的质量 将直接影响实验的可靠性。如果 RN A 中混有 DN A , 不但 会出现较高的背景, 而且 R T 2PCR 反应后电泳得到的差 异条带也很可能是假阳性。 因此, 提取的 RN A 应该用无 RN A 酶的DN A 酶消化, 以去除污染的DN A 4 。可设一对 照来检验 RN A 的纯度, 即省 略 逆 转 录 过 程 而 直 接 进 行 PCR 反应, 纯 RN A 不应有扩增产物。 另外, RN A 应尽可 能在相同条件下分离提取, 以减少偶然误差。RN A 的量 对差异显示效果有一定的影响。 在 20 ΛL 的反转录体系 m RN A 差异显示技术是基于 R T 2PCR 的基本理论 而建立的。 根据真核细胞 m RN A 含有 po ly (A ) 末端的特 点, 设计 3′端引物为 o ligo 2dT 12M N (M 、N 分别代表A 、C、 G、T 4 种碱基的