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毕赤酵母发酵手册 总览 简介： 毕赤酵母和酿酒酵母很相似，都非常适合发酵生长。毕赤酵母在有可能提高总体的蛋白质产量的发酵中能够达到非常高的细胞浓度， 我们建议只有那些有过发酵经验或者能得到有经验的人的指导的人参与发酵。因为发酵的类型很多，所以我们很难为您的个人案例提高详细的过程。下面所给出的指导是基于Mut+和Muts两种基因型的毕赤酵母菌株在15L的台式玻璃发酵罐中发酵而成。请在您的发酵开始前先阅读操作员手册。下面所给出的表就是整个指导的概况。 步骤 标题 页码 1 发酵参数 1 2 设备推荐和培养基的制备 2 3 培养中溶氧的测量和使用 3 4 种子液的培养 4 5 在分批和分批补料培养中生物量对应于甘油的生成 4-5 6 Mut+和Muts基因型重组子在甲醇分批补料状态下表达的介绍 6-7 7 细胞的成熟与衰退 8 8 参考文献 9-10 9 配方 11 发酵参数： 在整个发酵过程中监测和调控下列参数非常重要。下面的表格描述了这些参数和监测这些参数的原因。 参数 原因 温度（30℃） 在32℃以上的温度下生长不利于蛋白质的表达 溶氧（＞20％） 毕赤酵母利用甘油和甲醇需要氧气 pH（5.0-6.0和3.0） 对于外源蛋白分泌到培养基中和最适生长非常重要 转度（500-1500rpm） 使培养基中的氧浓度达到最大值 通气（玻璃发酵罐中为0.1-1.0vvm※） 使培养基中的氧浓度达到最大值取决于容器 消泡剂（消除泡沫的最小量） 过多的泡沫会引起分泌蛋白质的降低和罐顶空间的减少 碳源（变化率） 在发酵过程中要以不同的速率添加不同的碳源 ※每分钟1体积发酵液（L）中氧气的体积（L） 设备推荐： 下面是所推荐设备的清单： ·发酵罐的夹套需要在发酵过程中给酵母菌降温，尤其是在甲醇流加过程中。你需要一个固定的来源来提供冷却水（5-10℃）。这可能意味着你需要一个冷冻装置来保持水的冷却。 ·一个泡沫探针就像消泡剂一样不可或缺。 ·一个氧气的来源——空气（不锈钢的发酵罐需要1-2vvm）或者纯氧（玻璃发酵罐需要0.1-0.3vvm）。 ·添加甘油和甲醇的补料泵。 ·pH的自动控制。 培养基的准备： 你需要准确配置下列溶液： ·发酵所需的基本盐类（第11页） ·PTM1补充盐类（第11页） ·75ml的50％的甘油每升初始发酵液，12ml的PTM1补充盐每升甘油。 ·740ml的100％的甲醇每升初始发酵液，12ml的PTM1补充盐每升甲醇。 毕赤酵母生长的测定： 在不同的时间点通过测OD600的吸光值和湿细胞的重量来检测毕赤酵母的生长。培养的代谢速率通过通过观察溶氧浓度对应于有效碳源来测定。 溶氧的测定： 简介： 溶解氧的浓度时指氧气在培养基中的相关比例，溶氧100％是指培养基中氧达到饱和。毕赤酵母的生长需要消耗氧气，减少溶解氧的满度。毕赤酵母在生长时会消耗氧气，减少溶氧的程度。然而，因为代谢甲醇的最初阶段需要氧气，所以将溶氧浓度维持在一个适当的水平（＞20％）来确保毕赤酵母在甲醇上的生长就至关重要。准确测定和监测培养中的溶氧浓度将会为您提供关于培养状态和健康程度之类的重要信息。因此，精确校正您的发酵设备非常重要，请查阅您的操作手册。 溶氧浓度的维持： 很难依靠发酵罐的氧气转换速率（OTR）将溶氧浓度维持在20％，特别是在小型的玻璃罐中。在玻璃发酵罐中，通气一般约为0.1-0.3vvm（1L发酵液每分钟1L氧气）来提供氧气使DO保持在20％。氧气消耗的变化依赖于所添加的甲醇的总量和蛋白质的表达。 在通气为0.1-0.3vvm时，氧气可达到足够的水平，这在许多玻璃发酵罐中可以通过通入无菌空气来实现。在不锈钢发酵罐中，压力可增加OTR（与KLa有关）。 如果一个发酵罐不能提供足够水平的氧气，甲醇的添加需要因此适当降低。请注意降低甲醇的总量可能导致蛋白质表达水平的降低。 为了使蛋白质表达水平达到最大，发酵时间应被分割来以较低的流加速度添加相似水平的甲醇。对许多重组蛋白质来说，可以观察到甲醇消耗的总量和蛋白质产生的总量有直接的关系。 DO测量的用处： 在毕赤酵母生长阶段，消耗氧气而使DO浓度维持在较低水平。请注意不管是在甘油或甲醇中生长，都要消耗氧气。DO浓度可用来衡量代谢速率和碳源是否受抑制，代谢速率则是培养健康程度的一个指标。如果你希望能够完全的诱导AOX1启动子，确定碳源是否受抑制就非常重要。例如：DO浓度的改变可让你确定是否在添加甲醇前所有的甘油都已耗尽，其次还可以确定甲醇流加的速率是否超过消耗的速率。过多的甲醇（＞1-2％vvm）可能会产生毒害。 DO的调控： 如果碳源受到抑制，