金属硫蛋白清除羟自由基功能的研究.docVIP

北京大学学报 (自然科学版) ,第 35 卷 ,第 4 期 ,1999 年 7 月 Acta Scientiarum Nat uralium U niversitatis Pekinensis , Vol . 35 , No . 4 (J ul ,1999) 1) 金属硫蛋白清除羟自由基功能的研究 郑军恒 李海洋 茹 刚 茹炳根 (北京大学生命科学学院 ,北京 ,100871) 关键词 金属硫蛋白 ; 羟自由基 ; 亚型 中图分类号 Q516 引 言 0 金属硫蛋白 ( Metallot hio nein ,简称 M T) 是一类低分子量 、富含半胱氨酸的金属结合蛋白 。 1957 年 Margo shes et al 首次从马肾中分离出该蛋白 ,现发现 M T 几乎存在于所有生物体中 。 哺乳类动物的 M T 通常是一条 61 个氨基酸的肽链 ,其中含有 20 个半胱氨酸 ,结合 7 个二价金 属离子 。所有半胱氨酸都以还原型与金属离子配位而形成具有特定光谱学特征的金属巯基配 位簇1 。 由于 M T 特有的氨基酸组成与分子结构 ,它在体内担负着重要的生理功能 。M T 除了具 有对重金属的解毒作用及参与微量元素的储存 、运输外 ,它还具有增强机体的应激能力 、拮抗 电离辐射 、清除自由基等重要功能2 ,其中对 M T 清除自由基的研究越来越受到人们的关注 。 M T 清除·O H 的研究已有大量报道 ,但大多操作复杂 ,且关于 M T 不同亚型清除·O H 能 力的结果各异 。更重要的是 ,各位作者都没有提到所用 M T 样品的巯基含量 ,恐怕是个很大 的漏洞 。在本项研究中 ,我们采用细胞色素 C 氧化法3 比色测定 M T 清除·O H 能力 ,比较了 M T21 ,M T22 及不同氧化程度 M T (以每分子 M T 含巯基个数表示) 清除·O H 能力的不同 。 材料与方法 实验材料 ZnM T 为本实验室制备 ;细胞色素 C ( Sigma 公司) ; GSH ,Cys 均购自 Serva 公司 。 MT 蛋白浓度测定 ZnM T 在 011 mol/ L HCl 中 ,测 A 220 ,根据 A =ε·l ·c ,ε= 43 700 mol - 1 ·cm - 1 ·L 计算 M T 1 111 112 含量 。 113 巯基定量 按文献 4 方法测定 。 研究简报 Notes  114 细胞色素 C 氧化法检测·O H 采用文献 3 的方法 ,略作改动 。PB (0115 mol/ L ,p H 714) ,抗坏血酸 (50μmol/ L ) ,细胞色 素 C (50μmol/ L ) ,CuSO4 (50μmol/ L ) , ( 空白对照不加 CuSO4 ) ,最终体积为 1 mL 。25 ℃温育 90 min 后 ,用 U V2240 紫外可见分光光度计测 A 550 。计算ΔΑ 表示·O H 的生成 。ΔA = A 550 (空白) - A 550 (损伤) 。M T 对·O H 清除率的计算 :在以上反应体系中加入不同量的 M T ,25 ℃ 温育 90 min 后测 A 550 ,空白对照管不加 M T 及 CuSO4 。按如下公式计算 M T 的·O H 清除率 : A 550 ( M T) - A 550 (损伤) ·O H 清除率 = ×100 % 。 A 550 (空白) - A 550 (损伤) 结 果 2 211 MT 浓度与·O H 清除率的关系 在反应体系中加入不同量的 ZnM T22 (每分子含 1814 个巯基) ,结果如图 1 所示 。M T 清 除·O H 有 明 显 的 量 效 关 系 。为 了 证 明 起 清 除 自 由 基 作 用 的 是 M T , 本 文 作 了 相 同 浓 度 (717μmol/ L ) 的 ZnM T22 ,牛血清白蛋白与 ZnM T 中 Zn 浓度相当的 ZnSO4 溶液及变性 M T 清 除·O H能力比较 。结果如图 2 ,表明牛血清白蛋白 (B SA) 、ZnSO4 及变性 M T 均无清除能力 。 图 1 MT 清除羟自由基的量效关系 Fig. 1 Effect s of various M T co ncent ratio ns o n ·O H scavenging efficiency 图 2 ZnMT22 , BSA , ZnSO4 及变性 MT 清除羟自由基能力比较 Fig. 2 Co mpariso n of ·O H scavenging efficiency amo ng ZnM T22 , BSA , ZnSO4 and dena2 t