公猪精液dna提取与检测方法的优化设计.pdfVIP

公猪精液DNA 提取与检测方法的优化设计 刘向东 向安静 程文科 彭中镇 赵书红 （农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，华中农业大学农业，武汉，430070 ） 摘 要：笔者对猪精液基因组DNA 的提取方法进行了初步研究，旨在建立一种最优化的提取高质量的猪精 液基因组 DNA 的方法，为做好猪分子育种和分子生物学科学研究提供必要的技术支持。经过对比实验， 我们最终确定了最优处理，分述如下：使用自然分层后精液下层的精子沉淀代替原始精液来提取 DNA 能 够取得更好的效果；在本研究采用的 1.5ml 提取体系中加入 50～100ul 的精子沉淀，利用 PK 终浓度至 200ug/ml 消化6～12h ，随后采用氯仿抽提1 次，其余步骤按文中通用步骤所述，就可以获得高质量的基因 组DNA 。同时本研究也确定了低浓度琼脂糖凝胶电泳定性检测DNA 质量的最佳条件：琼脂糖凝胶浓度为 0.8%，电压为80V/20cM ，DNA 上样量为2ug，电泳至少30min 。 关键词：猪 精液 DNA 提取 DNA 检测 优化 基因组DNA 是动物遗传物质的载体，随着分子生物学和分子育种的发展，基因组DNA 提取与保存成为动物科学实验和生产育种过程中越来越重要的内容之一。猪是我国重要的动 物性蛋白来源。在实际育种生产和科学研究过程中，我们通常需要大量高质量的公猪基因组 DNA 来进行遗传鉴定和科学实验。通常情况下这些 DNA 是从动物的血液、肌肉以及肝脏 等组织中获取的。对于公猪而言，公猪的精液是相对于其他组织更容易获得的，所以利用精 液来提取公猪DNA 是更有效的方法。但国内目前尚没有最优化的公猪精液基因组DNA 提 取方案的报道。 提取动物基因组DNA 的方法种类繁多，目前主要分成两种，一是试剂盒法，二是经典 的酚仿抽提法。试剂盒法的优点是简便、快捷，但缺点是价格昂贵，有的产品DNA 产率较 低。酚仿抽提法虽然操作略微繁琐，但总的来讲价格便宜，而且能够获得高质量的基因组 DNA，所以目前应用十分广泛。在利用酚仿抽提法提取基因组DNA 的过程中，每一个环节 均可影响实验的结果，其中初始样品类型、初始样品量、PK 剂量与消化时间和酚抽提次数 是重要的影响因素。因此，笔者基于经典的酚仿抽提法对猪精液基因组DNA 的提取方法进 行了初步研究，旨在建立一种最优化的提取和检测高质量的猪精液基因组DNA 的方法，为 做好猪分子育种和分子生物学科学研究提供必要的技术支持。 1 材料 1.1 试剂 生理盐水、蛋白酶K （20mg/ml）、氯仿/异戊醇 （24:1 ）、酚/氯仿/异戊醇 （25:24:1 ）、3M 作者简介：刘向东 （1983- ），男，华中农业大学动物科技学院博士研究生，师从赵书红教授，主要从 事分子生物学，免疫遗传学与动物育种的科研工作。  基金项目：国家自然科学基金广东联合基金(U 0631005)和863项目(2006AA10Z195)资助。  通讯作者：赵书红教授，博士生导师，主要从事动物功能基因组学和动物育种的研究工作。 NaAC 、10×TE Buffer （pH8.0 ）、5 ×精子提取液 10ml，混合均匀，高压灭菌，室温保存。 1.2 仪器和耗材 仪器设备：滴管、小烧杯；10ul、200ul、1000ul 微量移液器；高速冷冻离心机；PH 检 测仪等； 实验耗材：10ul、200ul、1000ul 枪头（用于吸取上清的要剪掉枪头尖）；1.5ml×3/样、 2ml ×1/样；酒精棉球等。 2 方法 2.1 不同因素对DNA 提取效果的影响 为了使比较基础一致，除改变的步骤外，其余的步骤均使用本文2.3 通用方法。 2.1.1 初始样品类型的不同提取效果 将精液静置，待其自然分层，上层为精清，下层为精子沉淀。分别从精清和精子沉淀中 各取200ul 提取DNA，每组3 个重复，比较其提取效果。 2.1.2 初始样品量对提取效果的影响 分3 组，每组4 个重复，别取50ul，100ul，200ul 精子沉淀来提取DNA，比较其提取 效果。 2.1.3 PK 消化时间对提取效果的影响 分3 组，每组2 个重复，加入精子提取液和PK 后，分别取消化4h 、12h 、48h 来提取 DNA，比较其提取效果。 2.1.4 PK 剂量对提取效果的影响