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BD流式细胞仪的使用程序scmc
流式细胞仪的使用程序
一.开机程序1. 检查稳压器电源,打开电源,稳定5分钟。2. 打开储液箱,倒掉废液, 并在废液桶中加入400ml漂白水原液。打开压力阀,取出鞘液桶,将鞘液桶加至4/5满(一般可用三蒸水,做分选必须用PBS或FACSFlow),合上压力阀。确实盖紧桶盖,检查所有管路是否妥善安置。3. 将FACSCalibur开关打开,此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY,预热5-10分钟。排出过滤器内的气泡。4. 如果需要打印,打开打印机电源。5. 打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志。6. 执行仪器PRIME功能一次,以排除Flow cell中的气泡。7. 分析样品时,先用FACAFlow 或PBS进行HIGH RUN约2分钟。X。做过分选后,每次开机后需冲洗管道:向分选装置上装上两个50ml离心管,不接通浓缩系统,摁下右下角白色按钮开始冲洗。待自动停止后接通浓缩装置,同上法冲洗一次。
二. 预设获取模式文件(Acquisition Template Files)1. 从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗,可利用此视窗编辑一个获取模式文件。2. 选取屏幕左列绘图工具中的Dot plot,绘出一个或多个Dot Plots(点图)。从Dot Plot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源,并确定适当的x轴和y轴参数。3. 选取屏幕左列绘图工具中的Histogram,同上法可绘出Histogram(直方图)。4. 将此视窗命名后储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest Folder \EXP文件夹中,下次进行相同实验时可直接调用。X. 本计算机中已设定两个模式文件:ACQ和EXP,储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest \EXP文件夹中,ACQ用于细胞DNA检测,EXP用于细胞表面标志分析。
三. 用CELLQuest进行仪器的设定和调整1. 从苹果画面中选取CELLQuest,进入CELLQuest后在File指令栏中打开合适的获取模式文件。2. 从屏幕上方Acquire指令栏中,选取Connect to Cytometer(快捷键: +B)进行电脑和仪器的连机。将出现的Acquisiton Control对话框移至合适位置。3. 从Cytometer指令栏中,开启Detectors/Amps、Threshold、Compensation、Status等四个对话框,并将它们移至屏幕右方,以便获取数据时随时调整获取条件。也可以用 +1,2,3,4获得此四个对话框。4. 在Detectors/Amps对话框中,先为每个参数选择适当的倍增模式(amplifier mode):线性模式Lin或对数模式Log。一般进行细胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴细胞亚群时,FSC和SSC多以线性模式Lin测量,且DDM Param选择FL2,而FL1, FL2与FL3则以对数模式Log测量;分析细胞DNA含量时,FSC,SSC,FL1,FL2,FL3皆以Lin进行测量,且DDM Param选择FL2;分析血小板表型时,FSC,SSC,FL1,FL2,FL3等均以Log进行测量。5. 放上待检测的样品,将流式细胞仪设定于RUN,流速可在HIGH 或LOW上。6. 在Acquisiton Control对话框中,选取Acquire,开始获取细胞。在以下的仪器调整过程中随时选取Pause,Restart以观察调整效果。未完全调整好之前不要去掉SETUP前的“3”。7. 在Detectors/Amps对话框中,调整FSC和SSC探测器中的信号倍增度:PMT voltages(粗调)与Amp Gains(细调),使样品信号出现在FSC-SSC点图内,且三群细胞合理分布。8. 在Threshold 对话框中选择适当的参数设定Threshold,并调整Threshold的高低,以减少噪音信号(细胞碎片)。一般做细胞表型时用FSC-H而做DNA时用FL2-H。Threshold并不影响检测器对信号的获取,但可改善画面质量。9. 从屏幕左列绘图工具中选取Region(区域),并在靶细胞周围设定区域线,即通常所说的门。圈定合适的细胞群可使仪器调整更为容易。10. 在Detectors/Amps对话框中,调整荧光检测器(FL1, FL2, FL3, FL4等)的倍增程度。根据所用的荧光阴性对照样品调整细胞群,使之分布在正确的区域内。11. 在Compensation对话框中,根据所用的调补偿用标准荧光样品调整双色(或多色)荧光染色所需的荧光补偿。比如应该为FL1+ FL2- 的细胞群却分布在FL1
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