人类抗原处理相关转运体2（TAP2）基因克隆及序列测定研究.pdfVIP

哈尔滨医科大学硕士研究生论文 中文 摘 要 目的:抗原处理相关转运体(transporterassociatedwithantigenprocessing,TAP) 属于ABC(ATP-bindingcassette)超家族成员，由TAPI(75KDa)和TAP2(71KDa) 形成异二聚体，负责抗原肤从胞浆到内质网的转运，在MHCI类分子的抗原处 理及提呈过程中发挥重要作用。TAP结构和功能障碍将导致细胞表面MHCI类 分子表达缺陷，这成为肿瘤细胞、病毒感染细胞逃逸免疫监视的重要机制。鉴于 此，本实验利用RTPCR技术获得人类抗原处理相关转运体亚基TAP2cDNA片 段，并构建其真核表达载体pcDNA3.1N5-His-TOPO-TAP2，为真核细胞表达 TAP2分子以及进一步研究其功能奠定基础。方法:以EB病毒刺激的人类B淋 巴母细胞系 (Blymphoblastoidcelllines,B-LCLs)为实验材料，利用TRIM试 剂提取总RNA，将总RNA反转录为cDNA第一链。以cDNA为模板，根据人 类TAP2基因的cDNA序列设计引物，扩增TAP2特异性片段。将TAP2cDNA 片段与表达载体pcDNA3.IN5-His-TOPO连接，构建重组真核表达载体 pcDNA3.IN5-His-TOPO-TAP2，转化大肠杆菌TOP10，经过氨节青霉素抗性筛 选和PCR鉴定后进行测序分析。结果:经测序确认克隆得到的TAP2基因片段 与 OenBank登录的人类 .TAP2序列一致，己成功构建重组表达载体 pcDNA3.1/V5-His-TOPO-TAP2.结论:获得人类TAP2基团并构建了重组真核表 达载体，对TAP2基因产物在肿瘤细胞系的表达、进一步研究TAP2分子在肿瘤 基因治疗方面的作用具有重要的意义。 关键词: 抗原处理相关转运体一2(TAP2)基因克隆 序列分析 真核表达载 体 哈尔滨医科大学硕士研究生论文 CloningandSequencingofHumanGeneTAP2 (Abstract) 0句ectiveHumantransporterassociatedwithantigenprocessing(TAP)proteinisa heterodimerconsistingoftwosubunitsTAPI(75KD)andTAP2(71KD),belongingto thesuperfamilyofATP-bindingcassette(ABC)transporters.TAPisresponsiblefor thetransportofantigenicpeptidesrfomthecytosoltothelumenoftheendoplasmic reticulum(ER)andplaysacrucialroleintheprocessingandpresentationoftheMHC classIrestrictedantigens.AbnormalitiesinstructureandfunctionofTAPleadtoa lossofcellsurfaceexpressionofMHCclassImolecules.Thismaybeanimportant mechanism fortumorsandvirus-infectedcellstoescapeimmunesurveillance Therefore,thecDNAencodinghumanTAP2genewassuccessfullyobtainedby RTPCRanditsrecombinanteukaryoticexpressionvectorpcDNA3.1N5-His- TOPO-TAP2wasconstructedinthisstudy.Thisworkwillcontributetoexpressing TAP2geneproductsineukaryoticcellsandfurtherstudyingthefunctionofTAP2 protein.Methods TotalRNAwasextractedrfom theEBVtreatedhumanB lymphoblastoidcelllines(B-LCLs)usingTRIzolreagent.ThenthetotalRNAwas tr