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利用流式细胞术检测T 淋巴细胞表面分子CD3、CD4和CD8封闭效率在反复自然流产中的应用发布时间：2014-05-12 11:25:40?来源： 创新医学网?浏览次数：58次封闭抗体主要是指孕妇针对胚胎主要组织相容性抗原(MHC)、滋养层细胞及淋巴细胞交叉反应抗原(TLX)产生的特异性IgG 类抗体[13]。正常状况下，封闭抗体从妊娠初期开始产生，至妊娠3 个月达到最高，以后逐渐下降，分娩时又增高。封闭抗体缺乏是造成早期复发性自然流产(RSA)的重要因素之一[4]。因此，目前临床上对于RSA 封闭抗体检测主要采用ELISA 方法，该方法是将MHC 混合抗原包被于96孔板中，检测受检者的血清中是否存在MHC 的抗体。该方法的设计理念是从源头寻找RSA 的致病因素，但是由于RSA 是多因素的集合体，因此，还有很多RSA 患者不能单纯用是否缺乏封闭抗体来进行解释。本研究从免疫应答的结局上寻找RSA 发生的原因，即利用流式细胞术检测T 淋巴细胞表面分子CD3、CD4和CD8的封闭效率，通过该方法，其目的是建立快速、准确、简便易行的手段，有利于临床诊断和疗效观察，同时可以进一步对RSA 的免疫学发生机制进行解释。1　资料与方法1.1　一般资料　反复自然流产组(RSA 组)标本来源于郑州大学第三附属医院2011年7月至2013年5月门诊就诊患者，共计1638 例，年龄20～46 岁，平均(32±6.8)岁。其诊断标准为患者有2次或2次以上的自然流产病史，同时排除夫妇双方染色体异常、母体生殖道解剖结构异常、内分泌失调、生殖道感染和自身免疫病等;健康对照组为正常妊娠来本院进行孕期保健者，共计100例，其妊娠均在12 周以内，年龄24～36 岁，平均(27±2.9)岁，且既往无自然流产、死胎、死产史，同时排除夫妇双方染色体异常、母体生殖道解剖结构异常、内分泌失调、生殖道感染和自身免疫病等，本次妊娠期间无阴道流血和腹痛等先兆流产症状和体征，超声检查证实胚胎发育正常者。1.2　试剂　CD4FITC/CD8PE/CD3PerCP混合单克隆荧光抗体、红细胞裂解液购自美国BD 公司;淋巴细胞分离液(北京鼎国生物技术公司)。1.3　方法　采集夫妇双方静脉血，并用EDTANa2 抗凝。采用流式细胞术检测T 淋巴细胞表面标志CD3/CD4/CD8阳性细胞百分数。每对标本取2支流式细胞专用管，第1管为对照管，加入男方血浆和全血各50μL，第2管为测定管，加入女方血浆和男方全血各50μL;然后再加入10μLFITCCD3/PECD4/APCCD8混合单克隆荧光抗体;震荡混匀，室温避光15min;加入1× 红细胞裂解液，混均，室温避光10 min;0.1mol/LPBS洗涤3 次，每次1500r/min，5min;最后加入100μLPBS，等待上机。封闭效率(%)= 对照管CD3/CD4/CD8阳性细胞百分数- 测定管CD3/CD4/CD8 阳性细胞百分 数;结果判定：CD3、CD4 和CD8 封闭效率只要有一项出现负值，提示封闭抗体缺乏;三项封闭效率均为正值，提示正常。免疫治疗：分离获取RSA 患者丈夫或无关健康第三者抗凝静脉血30mL，并提取单个核细胞，调整细胞浓度为(5～10)×107/mL，每次取100μL 分3～5点注入女方前臂皮下，3次为一个疗程，每次间隔2～3周。治疗1个疗程后进行封闭抗体检测，若封闭抗体转阳鼓励患者6个月内自然妊娠，并在妊娠前3个月加强免疫治疗;若封闭抗体仍为阴性，则进入下一个疗程治疗。1.4　统计学处理　数据以狓±狊表示，采用SPSS11.0统计软件分析，组间比较采用两样本χ 2 检验。p0.05 表示差异有统计学意义。2　结　　果2.1　RSA 组与健康对照组封闭抗体缺乏率　1638 例RSA患者中封闭抗体阴性(只要CD3/CD4/CD8封闭效率中有一项出现负值即规定为封闭抗体缺乏)1459例，阴性率为76.86%(1259/1638)，100例健康对照组中封闭抗体阴性8 例，阴性率为8.00%。RSA 组封闭抗体阴性率明显高于健康对照组，差异有统计学意义(p0.01)。2.2　T 淋巴细胞表面分子CD3、CD4 和CD8 的封闭效率　RSA 组中，CD3封闭效率为(-2.8±1.9)%，CD4封闭效率为(-1.8±1.2)%，CD8封闭效率为(-1.2±1.2)%;而健康对照组CD3封闭效率为(1.5±1.0)%，CD4 封闭效率为(0.6± 0.6)%，CD8封闭效率为(0.9±0.5)%。RSA 组和健康对照组中CD3、CD4和CD8封闭效率之间比较差异有统计学意义(p0.01)2.3　RSA 患者T 淋巴细胞表面分子CD3、CD4 和CD8 封闭效率阴性百分比　在RSA 患者中，CD3 封闭效率阴性占71.0