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定量测定 荧光分析法的定量测定方法较多，常用的有以下两种。 （1）标准曲线法：将已知含量的标准品经过和样品同样处理后，配成一系列标准溶液，测定其荧光强度，以荧光强度对荧光物质含量绘制标准曲线。再测定样品溶液的荧光强度，由标准曲线便可求出样品中待测荧光物质的含量。 C F 标准工作曲线图 Fx cx F = K C （2）比例法（直接比较法）：配制已知对照品溶液的浓度Cs，测定其荧光强度Fs，然后在同样条件下测定试样溶液的荧光强度Fx ,便可求得试样中荧光物质的含量Cx 。如果空白溶液的荧光强度调不到零，则必须从Fs和Fx值中扣除空白溶液的荧光强度F0，然后进行计算。 0 x 0 s F F F F --__ - = x s C C 求出Cx （3）联立方程法：多组分混合物的荧光分析 定性分析在分光光度法中，被测物质只有一种特征的吸收光谱。 荧光物质的光谱包括激发光谱和荧光光谱两种。因此，鉴定物质的可靠性较强。 当然，必须在标准品对照下进行定性。 第三节 荧光分光光度计 由光源、单色器、样品池、检测器和记录系统五部分组成。 样品池 显示器 单色器 检测器 I0 It IF 光源 单色器 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角 仪器分析 第八讲 主讲教师：刘忠英　　　　　　　　　　　　　　　　　　　学时：32　 第十一章 荧光分析法 光致发光 某些物质经光照射时，除吸收某些波长的光之外，还能放射出能量较低（亦即波长较长）的光，这种现象称为光致发光。 荧光 物质分子接受光子能量激发后，由激发态的最低振动能级下降到基态时发射出的光为荧光。 荧光分析法 某些物质的分子能吸收能量而发射出荧光，根据 荧光的光谱和荧光强度，对物质进行定性或定量的方法，称为荧光分析法。 种类：分子荧光，原子荧光。(紫外荧光和可见荧光，还有红外荧光、X射线荧光等)。 特点： （1）荧光光谱第一个主要优点是灵敏度高、选择性好： 由于荧光辐射的波长比激发光波长长，因此测量到的荧光频率与入射光的频率不同。另外，由于荧光光谱是发射光谱，可以在与入射光成直角的方向上检测，这样，荧光不受来自激发光的本底的干扰，灵敏度大大高于紫外-可见吸收光谱，测量用的样品量很少，检测限低10-10 ~ 10-12g/mL。 （2）荧光光谱第二个主要优点是信息量大： 荧光光谱能提供较多的信息，例如激发光谱、发射光谱、峰位、峰强度、荧光寿命等。在生化分析中的应用较广泛。 一、荧光分析法的基本原理 二、荧光定量分析方法 三、 荧光分光光度计 第一节 荧光分析法的基本原理 一、分子荧光 （一）分子荧光的产生 1. 分子的电子能级与激发过程 当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后，被激发跃迁到能量较高的轨道上，电子 自旋方向不改变，为激发单 重态； 以、S0 、 S1* 、 S2*表示. 如果电子在跃迁过程中，伴随 着自旋方向的改变，这时便 具有两个自旋不配对的电子， 这种受激态称为激发三重态； 以T1* 表示.三重态的能量较低。 2.荧光的产生 分子在室温时基本上处于电子能级的基态，当吸收了紫外－可见光后，基态分子中的电子跃迁到激发单重态的各个不同振动－转动能级，（不能直接跃迁到激发三重态的各个振动能级）。 处于激发态的分子是不稳定的，以辐射跃迁和非辐射跃迁的方式释放能量，返回基态。 非辐射能量传递过程 振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂分子 间发生碰撞，把一部分能量以热的形式迅速传递给溶剂分 子，回到同一电子激发态的最低振动能级的过程。 内转换：当激发态S2*的较低振动能级与S1* 的较高振动能 级的能量相当或重叠时，分子有可能从S2*的振动能级以无 辐射方式过渡到S1*的能量相等的振动能级上的过程。 外 转 换： 激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；从S1*、 T1* 最低振动能级回到基态。 外转换使荧光或磷光减弱或“淬灭”。 体系间跨跃: 当电子激发单重态的最低振动能级与电子三重激发态的较高振动能级相重叠时，发生电子自旋状态改变的 S1*—T1* 跃迁，这一过程称为 “体系间跨跃” 。 荧光发射 无论分子最初处于哪一个激发单重态，通过内转换及振动弛豫，均可返回到第一激发单重态的最低振动能级，然后再以辐射形式发射光量子而返回至基态的任一振动能级上，这时发射的光量子称为荧光。 磷光发射 经过体系间跨越的分子再通过振动驰豫降至激发三重态的最低振动能级，分子在激发三重态的最低振动能级可以存活一段时间，然后返回至基态的各个振动能级，而发出光辐射，这种光辐射称为磷光。 分子吸收和发射过程的能级图 S0 :