应用荧光原位杂交和特异性寡核苷酸探针检测亚力山大藻属Alexandrium和塔玛亚力山大藻Atamarense的探索研究.pdfVIP

高技术通讯2003．3增刊 应用荧光原位杂交和特异性寡核苷酸探针检测亚力山大藻属 黄邦钦② 陈纪新 焦念志③骆庭伟 洪华生 (厦门大学海洋环境科学教育部重点实验室／环境科学研究中心 厦门361005) 摘要针对赤潮生物塔玛亚力山大藻(A／exandhumtamare／kse)的28SrRNA．5．8SrRNA 以及18S一28SITS rDNA序列和亚力山大藻属(A／exandr／um)28SrRNA序列设计了相应的3 一个特异性探针(mex28s01)。这些探针的特异性通过全细胞荧光杂交进行鉴定，荧光显 微镜的结果表明3个塔玛亚历山大藻的特异探针能够与目标藻细胞发生阳性反应；探针 针结合细胞与阴性细胞区分开来。3种辅助探针中Tama5s02和Alex28s02能够确实地加 强荧光的强度和杂交率。应用探针可以在多种藻种的混合水样中将目标细胞鉴别出来。 这些探针可望应用于监测自然水体中赤潮生物亚力山大藻属和塔马亚力山大藻。 关键词 荧光原位杂交，流式细胞仪，塔玛亚力山大藻，特异性探针 要包括了针对真核藻类和蓝细菌，目前数据库已记 0 引言 录有149种探针。对杂交的荧光信号检测主要通过 亚力山大藻属(Alexandrium)是重要的赤潮生荧光显微镜和流式细胞技术。前者在常规海洋实验 物，有许多全球分布的种类。在中国沿海，由于亚力 室中较为普及，而后者则具有高速度，高敏感性和定 山大藻属产生的麻痹性毒素(PSP)而引起了人们极量化的优势【5J。 大关注，针对它们的生理特征、毒素、产毒机制已经 本工作主要是设计并验证设计的探针的特异 开展了许多研究工作。基于形态学基础的传统分类 性，以及辅助探针对特异性杂交的增加效果。以便 学方法对于塔玛亚历山大的鉴定比较麻烦，具有很 可以应用这些探针结合流式细胞仪技术检测海水中 亚力山大藻属和塔马亚力山大藻的种群动态。 多困难，特别是对塔玛亚力山大藻(A．tomofferKse)与 链状亚历山大藻(A．catenella)的鉴定…。许多研究 l 材料与方法 者开始采用分子生物学技术来研究它们的遗传特 征，寻找合适的不同属、种或地理株的遗传标 1．1藻种(株)与培养条件 ii三[2，3|。 共有15种藻株应用于原位荧光杂交实验，分属 分子生物学技术已经被成功地应用于鉴定微型 于4个纲(表1)。培养采用t72培养基，温度21℃， 生物和解决分类学问题。在浮游植物的研究中，～ 光照强度6000lux，光周期12：12。 般通过对18S和28SrRNA序列的分析来解决分类1．2核苷酸探针的设计 学与系统发生学的问题。这些序列往往包括保守区 与变异区，根据不同的保守性可以 历山大属所有株系和部分其他甲藻的18SrRNA序 设计出不同分类水平上的特异性寡 列、28SrRNA序列、5．8SrRNA序列以及28S．18S间 核苷酸探针HJ。目前已经开发了许 多针对rRNA序列的探针。欧洲行排列。手动精减排列结果，确定对目标分类水平 PICODIV项目(Roscoff，France)于 2002年建立了一个探针数据库，主BlastN接口对这些排列结果进行筛选。筛选后得到 ①863计划(2003脚5060)、自然科学基会和973(00lcB4蜊)资助项目。 ②男。1964年生，教授，博导；研究方向D：海--洋．微型生物生态、分子生态学。 ③联系人。 (收稿日期：2003-02．17) 一90— 黄邦钦等：应用荧光原位杂交和特异性寡核苷酸探