应用重组AAVrSTAP进行肝硬化靶向基因治疗的研讨.pdfVIP

应用重组AAV/rSTAP进行肝硬化靶向基因治疗的研究 摘 要 肝硬化是一种常见的慢性肝病，严重危害人们健康。肝纤维化是一切慢性肝 病的共同病理学基础，是形成肝硬化的必经病理阶段。肝星状细胞在肝纤维化过 程中发挥关键作用。本实验在克隆星状细胞激活相关蛋白 (stellatecell activation-associatedprotein,STAP)基因的基础上，成功的进行了其重组腺相关 病毒载体 (rAAV2/rSTAP)的构建，并应用rAAV2/rSTAP进行肝硬化基因治疗 的研究，为临床有效防治肝硬化探索有效的新的途径。 肝星状细胞h〔epaticstellatecell,HSC)在肝纤维化的发生发展中起核心作用。 本实验参照链霉蛋白酶、胶原酶原位循环灌流法分离纯化SD大鼠肝星状细胞， 得率约为1.3X10/肝，细胞存活率90%,desmin免疫组化染色阳性率约98%e WesternBlotting结果显示正常HSC表达STAP极少，rAAV/rSTAP转染后肝星状 细胞STAP表达明显增加。本实验采用FeIAA法复制大鼠肝星状细胞氧化应激模 型，结果显示，HSC氧化诱导对照组 (PBS+Fe/AA)和HSC氧化诱导载体对照 组 (rAAV/eGFP+Fe/AA)细胞内、培养基内的MDA均显著高于未有Fe/AA处 理的正常HSC对照组，和rAAV/STAP十Fe/AA处理组 (尸切01,ANOVA)oHSC 氧化诱导对照组 (PBS+Fe/AA)和 HSC 氧化诱导载体对照组 (rAAV-2/eGFP+Fe/AA)的细胞内、培养基内的4-HNE均显著高于未有Fe/AA 处理的正常HSC对照组，但HSC氧化诱导对照组 ((PBS十Fe/AA)和HSC氧化 诱导载体对照组(rAAV-2/eGFP+Fe/AA)细胞内的4-HNE与rAAV-2/STAP+Fe/AA 处理组相比无显著差异。HSC氧化诱导对照组 ((PBS+Fe/AA)与HSC氧化诱导 载体对照组 (rAAV2/eGFP+Fe/AA)的细胞内、培养基内的MDA和4-HNE无 显著差异。 与未受Fe/AA氧化诱导的正常HSC(PBS)对照组相比，HSC氧化诱导对 照组和HSC氧化诱导载体对照组的TIMP-1,TGF-邵水平显著增高。与HSC氧 化诱导对照组 (PBS+Fe/AA)和 HSC氧化诱导载体对照组相比， rAAV-2/STAP+Fe/AA处理组的TIMP-1,TGF-p1mRNA水平明显降低。 近年来很多研究证实核转录因子在HSC激活和肝纤维化形成过程中起十分 重要的作用。本研究结果显示氧化应激促使C-jun蛋白表达增加、AP-1结合活 性增强，HSC细胞核内NF-kB水平明显增高;而STAP可以减少因氧化应激所 致。jun蛋白表达增加和AP-1结合活性增强以及细胞核内NF-kB水平的增高。 目的基因是否转移至体内目的组织，是否稳定、有效的表达是基因治疗的关 键之一。为检验rAAV-2/STAP是否有效感染大鼠肝脏并稳定有效表达目的蛋白 STAP，给SD大鼠门静脉注射rAAV-2/STAP，滴度为3x10,2周后处死动物。 分别作苏木精一伊红染色(HE染色)、免疫组化染色、原位杂交实验和免疫荧光双 染色。实验结果显示:rAAV-2/rSTAP组STAP表达明显增高，阳性染色细胞也 主要分布在汇管区。免疫荧光双染色结果进一步证实STAP阳性染色细胞主要是 desmin染色阳性的肝星状细胞，而肝细胞很少，占全部肝细胞总数不足5%. 本实验采用改进CC14灌胃给药法建立肝硬化模型，各组大鼠分别门静脉给 予滴度为3x10’的rAAV2/eGFP,rAAV2/rSTAP，对照组给于相同体积的生理盐 水。两周后，用于肝硬化模型制作的大鼠，50%CC14一橄榄油灌胃，每周1次， 开始剂量O.1mUl00g,4周后剂量根据体重调整为。.3ml/lOOg，正常对照组予以 等体积橄榄油，共12周。rAAV2/rSTAP可明显改善模型大鼠肝功能。与正常对 照组相比，模型对照组、CC14-rAAV/eGFP组、CC14-rAAV/rSTAP组的AST和 ALT有显著升高 (P0.01):与模型对照组相比，CC14-rAAV/eGFP组无显著变化 (P0.05);CC14-rAAV/rSTAP组的AST和ALT有显著降低 (P0.01)。另外， CC14-rAAV/rSTAP组的AST和ALT明显低于CC14-rAAV/eGFP组 (P0.0