线粒体内膜蛋白Tim23的克隆及其验证.pdfVIP

摘 要 作者利用生物信息学技术，以电子克隆方法成功地克隆到了人类 新基因Tim23的cDNA全序列 (1197bp)，经Genbank确认为新基因 (Genbank登记号:AY442341)。染色体定位为 10gll.21-g11.23, 该序列是迄今为止报道过的唯一完整的Tim23序列，更为重要的是， 我们利用实验验证的技术路线，以电子克隆得到的ORF序列为模板 设计引物，利用RTPCR法从体外培养的人胚肺成纤维细胞cDNA中 扩增该序列，结果经测序及EST数据库检索均证实了在人胚肺成纤 维细胞中存在着Tim23的编码区。 这些研究成果为将来研究Tim23今后进一步探索Tim23对细胞 生长影响的研究奠定了基础。 关键词:线粒体 Tim23EST 电子克隆 RTPCR 人胚肺成纤维 细胞 Abstract Wehaveidentifliedandanalysizedanovelhumanmitochondrial innermembranetranslocase (Tim)splicingregulatoryprotein(Tim23) gene.Thefull-lengthcDNAof1197byforhumanTim23wascloned throughablastsearchofpublicdatabasesfollowingtheidentificationofa cDNAcontigof400byobtainedbyESTassemblywithfullrobotization insupercomputerinlarge-scale.Sturcturally，humanTim23encodesa polypeptideof210aminoacids，ismappedtothehumancytogenetic region 10gll.21-g11.23usingthebioinformaticanalysis. Furthermore，wehaveexperimentallyclonedandsequencedacDNA rfagmentof630bpcontainingthefull-lengthORFof629bpinthisnovel humangenebyRTPCRrfomthesingle-strandedhumanplacentallung fibroblastcDNA library(Clontech)，whichisfullyidenticalwiththatof theinsilicocloningdetermined妙thenucleotidesequencing.Thus，we insilicoclonedthisgengwithGenBankaccessionnumberofAY442341 identifiedsolelybybioinfonnaticanalysisofthenucleotideandprotein. Thisisanimportantbasicfoundthatsupport thescientificresearch ofhowTim23influncingtheprocessofthelungfibrosis. Keywords:mitochondriaTim23EST InSilicoCloning RTPCR 前 言 蛋白质是生物体的主要组成物质之一，也是生命活动的基础。在细胞中蛋白 质在核糖体上合成。数以万计的蛋白质合成以后分送到细胞各部分(细胞液、细 胞核、线粒体、内质网、溶酶体等等)。合成的蛋白质必须定向地、准确无误地 进行运送，才能保证细胞活动的正常进行。对于亚细胞结构和细胞器来说，合成的 蛋白质运到有关部位后还需跨膜(有的甚至要通过多层膜)运送，才能“各就各位” 发挥其正常功能。 近年来，线粒体在细胞中的作用越来越受到重视。据估计Dl，线粒体(包括 外膜，内膜，内外膜间隙，基质)内含的1000种左右蛋白质，其中98%的线粒体蛋 白质是由细胞核编码、细胞质核糖体合成后运往线粒体的。其中大部分到达线粒 体的蛋白质需要跨过线粒体双层膜到达基质(21。定位于基质的蛋白质在细胞质核 糖体合成时都带有导肚。它们在定向运送线粒体时都处于伸展状态，细胞液内的 “分子伴侣”(如，热休克蛋白CH