T型钙通道α1H亚单位基因在细胞增殖中的作用.docVIP

精品论文 参考文献 T型钙通道α1H亚单位基因在细胞增殖中的作用 陈新 摘要：通过采用稳定过量表达T 型钙通道alpha;1H亚单位基因（CACNAIH）的HEK- 293( human embroyonic kidney)细胞来研究alpha;1H 亚单位基因（CACNAIH）在 细胞增殖中的作用。采用标准全细胞膜片钳来记录从mRNA 转录水平和T 型钙通道蛋白质功能水平来验证alpha;1H亚单位基因的过量表达。通过实验结果表明T 型钙 通道alpha;1H亚单位基因能够促进细胞的增殖，提高了与细胞周期有关基因的蛋白质表达水平，从而为开发治疗与细胞增殖异常有关的疾病提供有关的理论根据。 关键词：T 型钙通道；亚单位基因；细胞增殖；作用 动脉粥样硬化（Atherosclerosis）是动脉硬化中最常见而重要的类 型，主要的特点是受累动脉的内膜有类脂质的沉着，复合糖类的积聚， 继而纤维组织增生和钙沉着，并有动脉中层的病变。这种病主要是累 计大型以及中型的肌弹力型动脉，最为常见的是冠动脉以及主动脉， 因此，把发生在冠动脉上的动脉粥样硬化称之为为冠状动脉粥样硬化 （Coronary Atherosclerotic）。目前最为创建的治疗冠状动脉粥样硬化 的方法主要是经皮冠状动脉腔内成形术( Percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)。经皮冠状动脉腔内成形术的细胞再次狭窄 主要是由于血管平滑肌的过度增殖，所以，要弄清楚血管平滑肌增殖 的生物学机制是当前最重要[1]。在本文中主要是通过构建T 型钙通道 alpha;1H亚单位基因的表达构件，利用HEK- 293( human embroyonic kidney) 细胞系来建立过量表达alpha;1H亚单位基因的稳定细胞株，从而探讨T 型 钙通道alpha;1H亚单位基因在细胞增殖与细胞周期有关基因的蛋白质表达 关系，阐述其主要作用。 1、实验材料以及方法 1.1、实验材料 采用分析纯；太牛血清（FCS）以及培养基（DMEM）；人类T型 钙通道alpha;1H亚单位基因（CACNAIH）；pcDNA3.1( + ) 表达载体。 1.2、实验方法 1. 2.1细胞培养 将T型钙通道alpha;1H亚单位基因克隆到真核表达再体pcDNA3.1( + ) 的EcoR V-Xba I位点上[2], 建成真核表达质粒pcDNA3. 1( + )-human alpha; 1H。通过利用浓度为1mg/ml的G418 筛选阳性克隆从而得到的稳定过 表达人类T 型钙通道alpha;1H 亚单位基因的细胞——HEKalpha;1H，HEKalpha;1H 对照着HEK- 293 细胞系在含有10%胎牛血清（ FCS）以及培养基 （DMEM）中，潮湿条件为5%的二氧化碳和95%的氧气的环境下， 同时在HEKalpha;1H中加入G418的浓度为1mg/ml。 1.2.2细胞增殖实验 在六孔的细胞培养板中每一个孔接种5times;103个细胞，培养至三 天、六天、八天以及十天后分别收获细胞，离心后的细胞重悬浮在 6ml 的osmocel 溶液中，采用Corlter Counter细胞计数仪来计算细胞数 量，每一种细胞，每一时间都通过计数3个培养孔的细胞，从而画出 生长曲线，重复三次以上实验，将三次的综合数据用Prism Graph Pad 软件计算出细胞群体的倍增时间。 1.2.3全细胞膜片钳记录 通过采用标准的全细胞法记录钙通道的电流[3]，用计算机控制 Axopatch 200A 膜片钳放大器，在22℃的温度下，微电极的电阻为 1-2MOmega;。钙通道的电流记录为：保持膜电位为-90mV，采用10mV的 间距为-80 到60mV,时间为两百毫秒区极化脉冲，记录不同牵制电压 下得钙电流，电流值用pA/pF 来表示。 1.3统计学分析 采用SPSS11.0 软件统计分析数据,计数资料比较采用x 检验,当 Plt;0.05 时，差异有统计学意义。 2、实验结果 2.1 HEKalpha;1H以及HEK-vector细胞增殖特点 HEKalpha;1H以及HEK-vector细胞的生长曲线区下图1 所示： 在上图中我们可以看到，HEKalpha;1H的细胞比HEK-vector细胞的增 长速度要快，尽管在接种时细胞数目是相同的，然而在每一个时间点 的细胞计数结果上