BIORAD电泳仪及SDS-PAGE凝胶电泳操作规范.docVIP

使用BIO-RAD电泳仪进行SDS凝胶电泳的操作规范 实验原理 根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白，在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移速率主要取决于亚基分子量的大小。 实验所用仪器 FR-200A全自动紫外与可见分析装置 上海复日科技有限公司 电泳仪 BIO-RAD公司 TS-1型脱色摇床 江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司 实验用试剂 低分子量蛋白Maker TAKARA 4*上样缓冲 TAKARA Pagn Blue protein staining solution Fermentas 试剂的配制 贮液的配制 凝胶储液 取30g丙烯酰胺+0.8g甲叉双丙烯酰胺0.8g ,先用35ml双蒸水溶解，搅拌，直到溶液变成透明，再用双蒸水稀释至100ml，过滤。棕色瓶4℃保存一个月。 （2）1 mol/l Tris-HCL (PH 8.8) 12.1g Tris(三羟甲基氨基甲烷)溶解在80ml双蒸水中，用4mol/l盐酸调PH至8.8。再用双蒸水稀释至100ml，保存在4℃冰箱。 （3）1.0 mol/l Tris-HCL (PH 6.8) 6.06g Tris溶解在40ml双蒸水中，用用4mol/l盐酸调PH至6.8。再用双蒸水稀释至50ml，保存在4℃冰箱。 （4）10%过硫酸铵（APS） 0.1g过硫酸铵+1ml双蒸水。使用前新鲜配制 （5）Tris–甘氨酸电泳缓冲液的配制（25mmol/L Tris；250mmol/L甘氨酸(pH8.3)） 30.3gTris+ 144.2g甘氨酸+ 10gSDS，双蒸水定容至1L。 每次使用时10倍稀释。 样品缓冲液 使用4*SDSloading buffer(Takara公司)，上样缓冲与样品比例1:3混匀，之后煮沸5min。 凝胶的配制 溶液成分 分离胶12.5% 10ml 浓缩胶4% 5ml H2O 2.05 3.51 凝胶储液 4.15 0.835 1.0mol/l Tris-Hcl(PH8.8) 3.75 1.0mol/l Tris-Hcl(PH6.8) 0.625 10%SDS溶液 0.08 0.06 10%过硫酸铵 0.1 0.1 TEMED 0.01 0.006 注：上表所标体积为配制两块胶的用量。若配制一块或多块，可按比例减半或加倍。 具体步骤如下： 1、样品制备：40 μL蛋白+5*上样缓冲液10 μL，煮沸5 min，冷却后放冰箱下层保存，备用 3、配制电泳缓冲及上样 取配好的10*电泳缓冲130ml，用蒸馏水稀释至1300ml。 将制好的凝胶用电泳夹固定至电泳槽中。注：短板朝里。若只跑一块胶，电泳夹的对面也必须放置一块电泳板。 倒入电泳缓冲液，液面至短板和长板之间。 每孔上样量最大20ul。蛋白Maker上样量7ul。 电泳 80V 45min;120V 45min。 注：若120v 45min后，溴酚蓝指示剂前沿距离电泳板下端太远，可延长电泳时间，或适当增加电压，待跑至距电泳板下端1cm时停止电泳。 剥胶 剥胶过程必须浸在蒸馏水中进行。 水洗 电泳结束后，用蒸馏水洗胶三次，每次10min。 染色 将胶至于脱色摇床上，使用考马斯亮蓝染色液（fermentas公司）过夜染色。 注：考马斯亮蓝染色液的使用，请严格按照染色液说明上的操作步骤进行。 考马斯亮蓝染液可重复利用3次，使用一次的染液请倒回使用一次的回收瓶中，使用过两次的染色液倒回使用两次的回收瓶中，用满三次才可废弃。 水洗 蒸馏水洗1-2小时，洗去背景色。拍照。 清洗胶板和电泳槽。 注：清洗和擦拭胶板时，请使用专用的医用棉口罩清洗，用水冲洗时，轻轻擦拭，将残留的胶清洗干净，注意不要太用力，以免划坏胶板。洗好后，放置专用的胶架上晾干，晾干后放入相应的胶盒中。 清理实验台，将实验仪器摆放整齐。 请大家务必保证电泳仪器的正确使用，及电泳槽盒电泳板的干净、清洁，为大家创造一个好的实验环境~~