猪病PCR检测程序.doc

猪 病 检 测 手 册 目录 猪瘟RT-PCR检测程序 3 猪繁殖与呼吸综合症RT-PCR检测程序 5 高致病性猪繁殖与呼吸综合症RT-PCR检测程序 7 猪流行性乙型脑炎RT-PCR检测程序 9 猪伪狂犬病毒（PRV）PCR检测程序 11 猪细小病毒（PPV）PCR检测程序 13 猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）PCR检测程序 15 细菌学检测程序 17 猪瘟RT-PCR检测程序 一 、病毒RNA的提取 1、阳性对照RNA的提取 材料 冻干猪瘟兔化弱毒疫苗、检测用病毒RNA提取试剂盒（）将1瓶猪瘟冻干疫苗用1.5ml蒸馏水或PBS液稀释，用1ml RNase-free管分装，每管500μl，-20℃保存。取出冻存的猪瘟病毒，解冻后离心，取上清用于RNA的提取。RNA提取按试剂盒说明进行，最后用50μl RNAase-free水溶解RNA，得到RNA溶液。 疑似病料RNA的提取样品采集采集病死或扑杀的猪，取等组织病变与健康部交界处组织；待检活猪，用注射器取血5ml，4℃保存，送检（病料要新鲜，严禁反复冻融病料）。 组织样品处理称取病变组织0.5g于研磨器中研磨，加入1.5ml继续研磨匀浆转至1.5ml灭菌离心管中，8000r/min离心min，取上清液用于RNA的提取；全血样品处理：待血凝后取血清用于RNA的提取。待检样品RNA的提取按试剂盒说明进行，最后用50μl RNAase-free水溶解RNA，得到RNA溶液。 RT-PCR反应 引物序列：F：5’-GACCTGGATGCGACTGACC-3’ , 19bp R：5’-GCGGCGAGTTGTTCTGTTAG-3’, 20bp目的片段为133bp。RT体系及反应程序：RNase-Free 水 6μl 特异性下游引物μl 1μl 模板RNAμl 11μl Total 12μl 12μl 置于PCR仪上65℃10min，立即冰浴5min。然后加入以下试剂：变性后的RNA溶液12μl 5×RT buffer 4μl dNTP mixture 2μl RNase Inhibitor 1μl Rever TraACE 1μl Total 20μl 按以下程序反转录： 1、 42℃，45min 2、 99℃, 5min 将cDNA ℃保存。PCR反应体系及程序ddH2O 7.5μl cDNA 3μl 上游引物1μl 下游引物1μl 2×Master mix 12.5μl Total 25μl 反应程序： 1、94℃，3min 2、95℃，30sec 3、5℃，30sec ×35cycles 4、72℃，1min 5、72℃，10min 、电泳用TAE电泳缓冲液配制1.8%的琼脂糖凝胶，100ml加入5μl染色液。80V电泳0min观察结果，在阳性对照出现133bp条带的情况下，样品如出现133bp的条带，判定为猪瘟阳性。材料冻干弱毒疫苗、检测用病毒RNA提取试剂盒（）将1瓶弱毒冻干疫苗用ml生理盐水或PBS液稀释，用1ml RNAase-free管分装，每管00μl，-20℃保存。取出冻存的病毒，解冻后用于RNA的提取。RNA提取按试剂盒说明进行，最后用50μl RNAase-free水溶解RNA，得到RNA溶液。 病料RNA的提取样品采集病死或扑杀猪，取病死或扑杀猪，取待检活猪，用注射器取血5ml，4℃保存，送检（病料要新鲜，严禁反复冻融病料）。组织样品处理称取病变组织0.5g于研磨器中研磨，加入1.5ml继续研磨转至1.5ml灭菌离心管中，8000r/min离心min，取上清液用于RNA的提取；全血样品处理：待血凝后取血清用于RNA的提取。 待检样品RNA的提取按试剂盒说明进行，最后用50μl RNAase-free水溶解RNA，得到RNA溶液。 RT-PCR反应引物序列：F：5’- -3’ , 18bp，TM为59.58。 R：5’--3’, 20bp，TM为57.8。扩增的目的片段为bp。RT体系及反应程序：RNase-Free 水 6μl 特异性下游引物μl 1μl 模板RNAμl 11μl Total 12μl 12μl 置于PCR仪上65℃10min，立即冰浴5min。然后加入以下试剂：变性后的RNA溶液12μl 5×RT buffer 4μl dNTP mixture 2μl RNase Inhibitor 1μl Rever TraACE 1μl Total 20μl 按以下程序反转录： 1、 42℃，45min 2、 99℃, 5min 将cDNA ℃保存。PCR反应体系及程序ddH2O 7.5μl cDNA 3μl 上游引物1μl 下游引物1μl