siRNA对猪肾细胞系PK15外源绿荧光蛋白基因表达的作用研究.pdfVIP

猪分子遗传与育种∞373 siRNA对猪肾细胞系PK一15外源绿荧光蛋白 基因表达的作用 张定校1程会军1周锐2刘榜1李奎1樊斌1 (1．华中农业大学动物科技学院动物分子生物学与育种实验室，武汉，430070) (2．华中农业大学动物医学院动物病毒学与传染病学实验室，武汉，430070) 因功能研究及核酸疫苗研制。 关键词：sIRNA；RNAi；绿荧光蛋白基因；PK一15细胞系 RNAi(RNA inteffer— RNA，dsRNA，或称为short 的有力工具，其实质是将针对目的基因的短双链RNA(double．stranded ence 确，但因其具有特异性、高效性、简便性等特点，已被广泛应用于无脊椎动物(如线虫、果蝇、斑马鱼)基因 功能、高等哺乳动物(如小鼠、鸡、猴、人)的基因功能或基因治疗研究[1。J。本研究拟在猪肾细胞系PK 基础。 1材料与方法 1．1 shRNA表达栽体构建 com／techlib／misc／siRNA neo载体说明书，设计出 finder．html)，序列如图1。根据pSilermerl”4．1一CMV DNA模板(每条55rIt)，序列分别为：正义链DNA模板(5，-GATCC shKNA的Oligo GAAG’【T】1ITCAAGAGA cAccc‘rGAAG‘r_rrc|I℃T1BAAAAcl代AGGGTcAG(mBcG一3DNA模板由大连宝生物公司合成。 7)。01iso Sensestrand 5’． CA-3 Ami．Sensestrand 3-GC ．5’ 图1．siEGFP靶序列结构 374四主垦塾塑堕焦亘壁受塞堂垦 4．1一CNV 接反应：1pl稀释sIRNA模板，6一无核酸酶水，1出pS／／encerneo载体，1出T4DNA连接酶，1出 T4 DNA连接酶缓冲液(10×)。16℃水浴过夜。 将连接产物转化人大肠杆菌(DHAa)，以氨苄青酶素抗性筛选，随机挑选4个克隆子进行扩增培养， 7一ACAYA2． GATIAAGTr删TA一3’；Reverse：5’一CGGTAGGCGTGTACGGTG一3’。 1．2猪肾细胞PK一15的传代培养 ． PK—15细胞系(ATCC 传染病学实验室提供。传代培养操作时，先倒掉原长满细胞培养瓶中的培养液，PBS清洗2次，再用灭 胎牛血清、2％双抗的DMEM培养液)，用吸管轻轻吹下细胞，吹打均匀后，按适当比例接种新细胞瓶，最 后加入一定量的生长液，置于37℃、5％COz的培养箱中静置培养。 1．3绿荧光蛋白表达载体和shRNA表达载体转染细胞 置Clontech公司。细胞转染试剂为LipofectmnineTM pEGFP—N】)和阴性(pEGFP—N1和Nc共转染，Nc即neuafive IX一70)下进行观察、拍照。 (Olympus 2结果与分析 随机挑选的4个克隆子经测序表明shRNA重组表达载体所插入的shRNA序列正确。 数绿荧光蛋白表达，这表明体内表达siRNA町能对转入的外源绿荧光蛋白基因表达产生了抑制作用。 但是这种抑制作用的真实程度如何，还需在绿荧光蛋白基因的mRNA和蛋白质表达量上进行检验，