SIV广东株的分离、鉴定及SI血清学诊断方法的研讨.pdfVIP

摘要 从广东省某发生呼吸道病的猪场送检的病料和棉签拭子中分离到一株病 毒，经AGP试验初步鉴定为SIV，病毒纯化后送国家流感中心进行H及N亚 型的鉴定，结果为H3N2亚型毒株，命名为A/Swine/Guangdong/1/2001(H3N2) (以下简称为SGDI)。对SGD1株进行形态学、理化特性和生物学特性方面 的研究，结呆表明:病毒粒子在透射电镜下多为圆形和椭圆形，大小在 80-120mn之间;病毒可感染犬肾传代细胞 (MDCK)，产生明显的细胞病变; 病毒不耐热，对乙醚、氯仿和酸 (pH3)敏感，胰蛋白酶可提高病毒的感染滴 度;病毒的组织培养半数感染量 (TCIDso)、鸡胚半数感染量 (EIDso),感染 一个病毒最小致死量的鸡胚平均死亡时间 (MDT)分别为 10-5/0.2mL, 10-688/0.2mL,108h;病毒以滴鼻途径感染小白鼠，小白鼠不出现明显临床症 状，但血清中出现特异性抗体:病毒以滴鼻途径感染60天龄实验猪，猪只仅 表现出轻微的临床症状，未发生死亡，血清中均可检测到特异性抗体。 利用自行设计的三对引物，通过RTPCR方法扩增出SGDI株HA基因5 端和3端及NA基因。DNA，然后分别将其克隆到pMD18-T载体中。测定的 序列经拼接后发现本毒株的HA基因全长 1701nt，只有一个开放阅读框架 (ORF)，共编码566个氨基酸残基组成的HA多肤;NA基因全长 1410nt. 只有一个ORF，共编码469个氨基酸组成的NA多肤。SGDI株的HA基因的 核昔酸序列与已发表毒株 A/Sydney/5/97,A/SwineIHK/2405/98, A/Swine/hk/2422/98 、 A/Swine/Iowa/569/99 、 A/Swine/Minnesota/593/99 A/Swine/Ontario/41848/97(均为H3N2亚型流感病毒)的核昔酸同源性在95% 到99%之间，氨基酸同源性在93.7%到98.7%之间;NA基因的核昔酸序列与 己发表毒株 A/Sydney/5/97,A/Swine/hk/2405/98,A/Swine/Iowa/569/99, A/HK/2/2000,A/Swine/Minnesota/593/99 (均为H3N2亚型流感病毒)的核昔 酸同源性在95.5%到98.9%之间，氨基酸同源性在94%到97.4%之间，同属于 N2亚型。系统发育树表明，SGDI株与香港、北美的H3亚型人及猪流感病毒 分离株的亲缘关系较近，处于同一分支上，而与欧洲分离株的亲缘关系较远， 处于不同的分支之上。分析表明SGD1株HA蛋白切割位点氨基酸组成不符合 高致病力AIV毒株分子特征，结合动物实验推断该毒株为非高致病力毒株。 将纯化的SGD1株种毒接种SPF鸡胚后，收获绒毛尿囊膜和尿囊液，分 别制成琼脂扩散抗原和HA试验用抗原。利用PEG平板进行AGP试验，敏感 性要优于普通平板;比较了RDE法、过碘酸钾法、高岭土法去除血清中非特 异性凝集抑制因子的效果，三种方法效果相当，但高岭土法成本最低，操作简 便，可以在实际工作中应用。 关键词 猪流感病毒 分离 鉴定序列分析 血清学诊断方法 本论文常用缩写词 AGP AgarGelDiffusionPrec娜tation 琼脂扩散试验 户JV Avianinfluenzavirus 禽流感病毒 Amp Ampicillin 氨节青霉素 by Basepair 碱基对 cDNA ComplementaryDNA (与RNA)的互补DNA DEPC Diethylpyrocarbonate 焦碳酸二乙酣 DNA Deoxyribonucleotideacid 脱氧核糖核酸 E.B Ethidiumbromide 澳化乙锭 EDTA Ethylenediammetetraaceticacid 乙二胺四乙酸