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纳米孔测序杨文清 一、引言： 双螺旋结构的发现，遗传密码的破解，第一个完整基因组图谱的绘制?让科学家越来越多地认识到测序在生物学研究中的重要作用。从1977年Sanger和Coulson关于快速测序技术论文的首次发表，到2010年高通量测序的广泛应用，海量遗传信息被相继揭秘；从人类基因组计划，到人类基因组单倍型图计划，再到人类癌症基因组及个体基因组计划，人类对于自身的研究也日趋深入。千元基因组计划的提出，后基因组时代的到来。势必推动测序技术的突飞猛进，人类对于自然界的认识也必将走向一个新的阶段。 二、测序过程： 新型纳米孔测序法是采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔来实现测序的。由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合物通过，因而可以在此基础上使用多种方法来进行高通量检测。此外，纳米级别的孔径保证了检测具有良好的持续性，所以测序的准确度非常高。对于长达1,000个碱基的单链 DNA分子、RN分子或者更短的核酸分子而言，根本无需进行扩增或标记就可以使用纳米孔测序法进行检测，这使得便宜、快速地进行DNA测序成为可能。如 果对现有纳米孔测序法进行进一步发展和改进，那么它将有望成为第三代测序技术（也可称为下、下一代测序技术），从而帮助人们实现24小时内只花费 1,000美元完成二倍体哺乳动物基因组测序这一目标。 一个盛满电解质溶液的容器被一纳米孔膜隔成两半，如果施以比较小的电压，如约100mV电压，就能使用标准的电生理检测手段测量通过纳米孔的电流大小。很多生物电通道的开关都是靠小肽段分子是否堵塞通道来实现的。基于这个事实，加州大学圣克鲁兹分校的Deamer和哈佛大学的都不约而同地提出一个构想：如果DNA分子或者RNA分子也能堵塞某个通道，那么应该可以运用上述方法来检测电流。接下来，Deamer和 Branton等人证明了单链DNA和RNA分子能通过蛋白质组成的孔道，并且能检测到它们通过这种纳米级孔道时所造成的电流改变。他们使用的孔道蛋白是金黄色葡萄球菌α溶血素。这种蛋白以前曾被Bayley小组用作生物传感器。Bayley小组发现，α溶血素蛋白非常稳定，即使在接近 100的情况下也能维持正常的功能。Deamer和Branton等人发现，因为α溶血素蛋白孔径非常小，简直与单链核苷酸的直径相差无几，所以可以将折叠卷曲的核苷酸链解开，并仅允许它以单链的形式通过蛋白孔道。单链核苷酸分子穿过蛋白孔道时会造成局部电流改变，即相比没有分子穿过时的电流强度有所减小。基于这个现象，Deamer和Branton等人猜测，如果核酸分子中每一个核苷酸通过孔道时都能出现一种特定形式的电流改变，那么通过分析电流改变的情况不就能知道核酸的序列了吗？ 为了验证这个想法，Deamer小组、Meller和Branton小组使用好几种不同的RNA分子和单链DNA分子进行了研究，以观察它们对电流的影响。结果发现，polyC RNA分子引起的电流强度下降比polyA RNA分子要强得多。此外，他们还发现，由30个A和70个C组成的RNA分子在序列从A转变成C时电流强度也会发生改变。不过不幸的是，这种嘌呤和嘧啶之间的明显差异没能在脱氧核糖核苷酸试验中发现。实际上，在RNA试验中观察到的polyA和polyC引起不同形式的电流改变是由碱基堆积和二级结构上的差异造成的。随后，使用不同DNA同聚物进行试验发现，脱氧嘌呤寡聚物和脱氧嘧啶寡聚物引起的电流改变差别并不大，只有不足5%。而且这种电流改变差异是由10~15个核苷酸（占据了α溶血素蛋白的跨膜区）引起的它无法区别单个核苷酸引起的电流改变之间的差异。虽然这些最初的纳米孔实验并没有获得预期结果，但它们至少显示出纳米孔在单分子技术方面的应用优势，例如高度的敏感性，同时也带动了纳米孔核酸分析 技术的研究热潮，并在理论及实验方面取得了一些成果。自从发现在电场力作用下，长达1000个碱基的单链DNA分子也能通过纳米孔之后，人们就更加坚信， 廉价的纳米孔测序技术一定会成为现实。 获取较长的测序长度 纳米孔测序技术还有一个非常吸引人的优势，那就是测序距离长。因为纳米孔测序仪对通过的每个碱基进行测序，与前后的测序结果都无关。因此从原则上来 说，使用纳米孔测序技术，只要DNA链不发生断裂，并且能一直通过纳米孔，就可以一直检测下去。到目前为止，人们已经证明，长达25kb的ssDNA能够 一次性通过生物纳米孔，长达5.4kb的ssDNA能够一次性通过固态纳米孔。因此，如果检测技术能得到进一步的改善（能检测快速通过纳米孔的碱基），纳 米孔测序技术还是具有非常好的应用前景的。虽然现在还无法确切获悉纳米孔测序技术的准确度有多高，但可以确定插入、缺失等序列错误不会影响片段的读出长 度，因为相移在独立的单分子读序中并不是一个问题