生物制药工艺学 第15章 第四节 基因药物.pptVIP

第四节 基因药物 一、基因治疗的概念 1、基因治疗的定义:(P632页) 基因治疗是将人的正常基因或有治疗作用的基因导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。而用于基因治疗的核酸等称为基因药物（gene medicines） 在未形成概念前，20世纪70年代就开始临床实验，由于实验未取得成果，而且没有得到NIH的批准，广受抨击。 80年代，在动物身上进行了大量试验，为其临床应用奠定了基础。 1990年9月，临床实验正式开始。患者是一名患严重联合免疫缺陷症的年轻姑娘，她从父母处各继承了一个缺陷的ada基因，造成体内缺乏腺苷酸脱氨酶。 我国复旦大学的薛京伦研究小组，做了世界上首例血友病 Ｂ 基因治疗。 成功地对先天性重症免疫缺陷症进行基因治疗的法国基因治疗组组长艾伦·费希尔博士（左）和成员玛丽娜·卡巴甘那卡勃博士（右）。 2002年10月,一名法国男孩在接受试验性基因治疗后罹患白血病，而基因治疗很可能是白血病发病的原因。 Fisher说，他非常希望这种基因治疗方法从总体而言利大于弊。除基因治疗之外，治疗SCID的另一种治疗方法是近亲的骨髓移植。除非骨髓移植非常匹配，否则手术的失败率是25%。他强调说，这一失败率比现在接受基因治疗的11例患者的并发症发生率高2倍以上。 从基因角度： 对缺陷的基因进行原位修复 用正常有功能的基因置换有缺陷的基因 增补缺陷基因（不需要去除异常基因，而是另外转入与缺陷基因同源的有功能的基因来弥补缺陷的基因） 从治疗角度 导入基因以改变患者细胞的基因表达 导入基因： 缺陷基因相对应的有功能的同源基因 缺陷基因无关的治疗基因 基因治疗的两种形式 2、基因治疗的方式 基因矫正或置换 基因增补 基因封闭 其他 3、导入的方式 体外导入（ex vivo） 体外将基因导入细胞内 再将这种基因修饰过的细胞回输病人体内 使这种带外源基因的细胞在体内表达 达到治疗或预防的目的 体内导入（in vivo） 外源基因直接导入体内有关的组织细胞 使其进入相应的细胞 并表达 基因治疗的基本程序 二、治疗的基因的选择 目前临床试验的治疗基因： 合适的能达到治疗/预防的目的基因的cDNA 目的基因的cDNA的获得 cDNA文库中目的基因的克隆 人工合成基因片段 PCR法筛选扩增目的基因 三、载体系统--运送基因的工具 逆转录病毒载体 逆转录病毒载体的构建 3、腺相关病毒（adeno associated virus，AAV） 属于细小病毒科，其成熟病毒颗粒中有的含正链DNA，有的含负链DNA。不能独立繁殖，其繁殖依赖于辅助病毒（腺病毒或疱疹病毒）。基因组仅5kb，有两个ORF，5’和3’端各有一个由145个氨基酸组成的反向重复序列（ITR），对病毒的复制、整合、包装等有重要调控作用。 优点： 1)、反向末端重复序列中没有转录调控元件，减少激活原癌基因的可能性 2）、宿主广，只能形成慢性感染 3）、可发生位点特异性整合，有利于表达 4）、热稳定性好，而作为辅助病毒的腺病毒在60℃即被灭活 5）、安全性较好，本身不致病 4、单纯疱疹病毒（herpes simple virus，HSV） 双链DNA病毒，基因组大小152kb，可缺失多个基因仍保持复制能力。 特点： 1）、序列清楚 2）、可容纳至少30kb外源基因 3）、宿主广，可侵染脊椎动物各种细胞 4）、重组病毒培养过程中易得到较高滴度 5）、从外周进入神经系统，不影响神经元功能 但表达产物对多种类型宿主有毒性，且可引起严重免疫反应，要进入临床仍需改进 5、 痘病毒载体 痘苗病毒为线形双链的有包膜病毒, 其核心颗粒不依赖宿主细胞而独立引进转录和复制,宿主范围广泛，易于培养；痘苗病毒基因组中大量非必需基因的缺乏并不影响其在宿主细胞的复制能力,可允许在同一或不同非必需区插入多个基因 痘苗病毒缺点是载体对细胞的毒性,同时病毒能被人体的补体系统灭活并降解 四、靶细胞 1、造血细胞 常用反转录病毒，体外基因转移，弥散的组织多，分散广。对转入外源基因的细胞可检验，考虑安全性及有效性。 2、肌肉细胞 常用。肌肉细胞分布广，含量丰富，为“永久性”细胞，基因不会因分裂而丢失；细胞长而大，且为多核细胞，基因易转移和表达。为“非生命”器官，安全；溶酶体少，外源DNA不易被降解，基因存活时间长；血流丰富，产物可释放入血 3、皮肤 表皮涂抹或肤内注射裸露DNA活脂质体包裹DNA。安全、简便，易行，但皮