基于双向位点特异性PCR的金银花真伪鉴别方法研究.docVIP

精品论文 参考文献 基于双向位点特异性PCR的金银花真伪鉴别方法研究 1.湖南省宜章县中医医院 424200；2.湖南省宜章县中医医院 424200；3.湖南芷江侗族自治县中医医院 419100 【摘 要】目的 探析基于双向位点特异性PCR的金银花真伪鉴别方法。方法 选取来自11个产地的88份植物样本为研究对象，包括金银花真品、金银花伪品及两者混杂品，将其随机分为两组，每组44份。对照组采用实验鉴别，观察组采用双向位点特异性PCR技术辨别，对比分析鉴别效果。结果当退火温度为61℃时，真品金银花条带为468hp，伪品条带为324hp，正品金银花中掺杂5%以上伪品可同时出现正品与伪品条带，两组在鉴别结果有明显差异（P＞0.05）；观察组的鉴别时间短于对照组（P＜0.05）。结论 双向位点特异性PCR检测技术可有效辨别金银花的真品、伪品及混杂品，在未破坏金银花样本组织结构及材质的情况下，可有效辨别金银花真伪，具有较强的优良性，更值得进一步推广和应用。 【关键词】双向位点特异性PCR；金银花；真伪鉴别 金银花又名忍冬，药科金银花属忍冬科忍冬属植物及同属植物干燥花蕾或带初开的花，外貌上形似于华南忍冬，具有清热解毒之功效。伪品金银花[1-2]主要包括苦糖果、金银木，且无正品金银花的药效，如被误当真品服用，将会延误治疗。因此，采用正确的方法对其真伪进行辨别尤为重要。本文选取来自11个产地的88份植物样本为研究对象，对双向位点特异性PCR鉴别金银花真伪的重要价值进行评价，具体如下。 1材料与方法 1.1材料 选取来自山东平邑、河南封丘、河北巨鹿、广西马山、湖南隆回及湖北、江西、广东、重庆、陕西、江西11个产地的88份植物样本为研究对象，所选样本主要包括忍冬32个，华南忍冬6个，灰毡毛忍冬8个，黄褐毛忍冬8个，水忍冬12个，金银忍冬6个，繁果忍冬7个，红腺忍冬9个。所有药材均经相关部门批准，符合药材选择标准[1]。同时，选取购自市场上经炮制的药材进行双向位点特异性PCR鉴别。 1.2仪器与试剂 1.2.1仪器 选用东胜龙二代ETC811新款PCR仪为检测仪器，温度为0-105℃，热盖温度30-110℃，显示精度为0.1℃，温度准确度性为plusmn;0.1℃@55℃，温度均一性为＜0.3℃@55℃，温度梯度为5℃/s，梯度跨度为1-42℃，输入电压为AC220V（plusmn;10%）50/60Hz。选用Eppendorf小型台式冷冻高速离心机5427R，温度范围为-11℃~40℃，离心计时为10s-10h，最大功率为550W，最大容量为48times;1.5/2.0ml。选用Biorad伯乐凝胶成像系统，检测器为CCD，像素为4.65times;4.65mu;m，像素密度为4096，工作湿度为＜70%，工作温度为10-28℃。 1.2.1试剂 SunShineBio琼脂糖（原产于西班牙，供应商：南京生兴生物技术有限公司）；Sigma-Aldric溴化乙啶（原产于美国，供应商：北京基尼亚生物技术有限公司）；Promega聚合酶（保定市凌业商贸有限公司）。 1.3方法 观察组：取干燥材料100mg，并提取入选材料的DNA，不同样品的DNA浓度约为10mg/L，利用引物（trnF、trnL，各0.2pmol）对PCR反应及DNA质量进行检测。在PCR扩增仪上进行反应，待反应结束后在反应体系中增加适量缓冲剂，待混合均匀后在EB染色的1%琼脂酸凝胶点上检测，并使用凝胶成像系统进行系统化的观察。 对照组：取该品粉末0.2g，加入5ml甲醇，并将其放置12小时后过滤溶液，使用照高效液相色谱法对金银花含量进行检测。 1.4统计学方法 本研究所有数据均采用SPSS13.0统计软件进行数据统计，计量资料用（ +s）进行表示，计数资料用%表示，Plt;0.05表示差异具有统计学意义。 2结果 2.1SNP位点的筛选与引物 根据数据库中显示的忍冬属植物的叶绿体序列，并使用软件对比不同序列间的内在联系，对忍冬属植物的trnF-trnL序列进行分析，结果显示trnF-trnL序列的625位均为G，而其他物种均为A。以SNP为主要位点，双向位点特异性PCR引物的序列情况如表1所示。 2.2双向位点特异性PCR反应条件 在建立单侧位点特异性PCR的基础上设计另一侧的引物，并优化反应循环数目及内侧与外侧的引物浓度，确定B