姜黄素对海人酸活化的小胶质细胞增殖和ERK１２表达的影响.docVIP

精品论文 参考文献 姜黄素对海人酸活化的小胶质细胞增殖和ERK１２表达的影响 王娜１　佟凤芝１　曾常茜２　王佳瑞１　佟静１　侯艺１ 　　１．大连市第五人民医院　辽宁　大连　１１６０２１;２．大连大学医学院,辽宁省生物有机重点实验室　大连　辽宁　１１６６２２ 基金项目:大连市科学技术基金计划项目(２００８J２１JH００５) 　　【摘要】　目的　观察姜黄素对海人酸活化的BV－２小胶质细胞增殖和ERK１/２表达的影响,探讨其可能的分子机制.方法　将BV－２细胞分为对照组、海人酸组和姜黄素组,免疫组化法检测各组BV－２细胞PCNA,免疫组化法检测各组BV－２细胞ERK１/２蛋白表达,RT－PCR 方法检测各组BV－２细胞ERK１/２ mRNA 的表达.结果　对照组BV２细胞PCNA 阳性率为(１５．６８plusmn;１．０３)％,海人酸组BV２细胞PCNA 阳性率为(６０．２４plusmn;１．２５)％,明显高于对照组(P＜０．０５),姜黄素组BV－２细胞PCNA 阳性率为(２０．３５plusmn;１．４６)％,明显低于海人酸组(P＜０．０５);海人酸组BV－２细胞ERK１/２蛋白表达与对照组比较显著增高(P＜０．０５),姜黄素组与海人酸组相比,ERK１/２蛋白表达显著降低(P＜０．０５);海人酸组BV－２细胞ERK１/２ mRNA 表达水平与对照组相比显著增高(P＜０．０５),姜黄素组BV－２ 细胞ERK１/２mRNA 表达水平与海人酸组相比显著降低(P＜０．０５).结论　姜黄素对海人酸活化的BV２小胶质细胞具有增殖抑制作用,其机制可能与下调BV－２细胞ERK蛋白和mRNA 表达有关. 【关键词】　姜黄素;BV－２细胞;增殖;ERK 【中图分类号】R２８５．５ 【文献标识码】B 　　【文章编号】１００８－６３１５(２０１５)１２－０３７３－０２　　 　　姜黄素(curcumin)是从姜科姜黄属植物姜黄、莪术、郁金等的根茎中提取出来的一种黄色小分子植物多酚[１].姜黄素是祖国医学中抗炎的常用药物, 具有抗炎、抗肿瘤、抗HIV、抗菌、抗氧化等多种药理作用,且毒性低,具有良好的临床应用潜力,受到国内外广泛的关注[２].本文通过检测增殖细胞核抗原(PCNA)观察姜黄素对海人酸活化的BV－２小胶质细胞增殖的影响,并检测姜黄素对海人酸活化的BV－２细胞ERK 蛋白和mRNA 表达的影响,旨在探讨姜黄素抑制海人酸活化的BV－２细胞增殖的分子机制. １　材料 　　１．１　细胞株BV－２小胶质细胞由中国医科大学免疫学研究室提供. １．２　试剂　海人酸购自Sigma公司;姜黄素(纯度９９％)购自Sigma公司;兔抗小鼠PCNA 抗体、ERK１/２抗体购自CellSignalingTechnology公司;羊抗兔IgG－HRP 购自CellSignaling公司;DAB 显色剂购自北京中杉金桥公司.HibernateA/B２７medium(HABG)、胎牛血清购自Fermentas公司;RT－PCR 反应试剂盒、Trizol、DEPC购自大连宝生物公司. 引物由大连宝生物公司合成:ERK１/２引物:Forward:５rsquo;－ACCTCCTGCTGAACACCACTT－３rsquo;Reverse:５rsquo;－GTCGTCCAACTCCATGTCAAACT－３rsquo;beta;－actin引物:Forward:５rsquo;－GAGGGAAATCGTGCGTGAC－３rsquo;Reverse:５rsquo;－CTGGAAGGTGGACAGTGAG－３rsquo; ２　方法２．１　BV－２细胞培养及传代　将BV－２细胞接种于含１０％胎牛血清、１００IU/ml青霉素、１００mu;g/ml链霉素的DMEM 培养基中,置于３７℃５％ CO２培养箱培养.每隔２－３d用０．２５％胰蛋白酶消化BV－２细胞并进行传代. 　　２．２　免疫组化法检测BV－２细胞PCNA 和ERK１/２ 表达　取对数生长期的BV－２细胞接种于内置有盖玻片的６孔细胞培养板,置于３７ ℃ ５％ CO２培养箱培养２４h,吸弃培养基.按上述２．１方法将BV－２细胞随机分为三组,继续培养２４h.吸弃培养基,用PBS 缓冲液洗涤２ 次.用７５％ 乙醇４℃ 固定１５min,干燥１０min,PBS洗３次.与３％ H２O２孵育１５min,PBS洗３次.正常羊血清室温封闭２０min.与兔抗小鼠PCNA、兔抗小鼠ERK１/２４℃孵育过夜,PBS洗３次.分别与羊抗兔IgG－HRP抗体室温孵育３０min,PBS洗３次.DAB染色,自来水冲洗,苏木素复染３０s,自来水冲洗,中性树胶封片,显微镜下观察各组BV－２细胞PCNA. ２．３　RT－PCR法检测BV－２细胞ERK１/２mRNA 表达水平　在各组