感染性疾病病原的诊断策略讲座.docVIP

感染性疾病病原的诊断策略 上海交通大学医学院病原生物学教研室 周与华 感染和感染性疾病一直是临床医学的重要课题，引起人们的广泛关注，自动化鉴定技术是怎样的？ELISA、核酸探针、PCR诊断、16S文库诊断技术的基本原理是什么？ELISA实验的主要实验策略和应用侧重有哪些？基因芯片技术的原理是什么？下面，我们共同探讨一下这些技术的原理策略以及发展的趋势。 在我们的日常生活中，小到一个皮肤创卫，大到肺炎，肝炎，性传播疾病，都有感染声音的存在。在感染性疾病的诊疗过程中，对于其感染性病原体的诊断处于一个非常重要的位置，因为他既帮助我们确定疾病的病原，又指导我们后期的治疗与用药，可以说是一个不可或缺的因素。但我们都知道，造成感染性病原体的千差万别，他们都具有不同的生物学特性，这就迫使我们用策略和手段去寻找他们。随着科学技术的发展，微生物学的鉴定和专断技术也有了长足的进步 一、病原诊断策略的分类 如今病原学的诊断技术多种多样，从最简单的手工平板划线分离到最常规的自动化细菌鉴定仪，到最新的DNA测取技术，病原学的诊断技术几乎覆盖了医学微生物学、分子生物学、生物化学的方方面面，具有很长的交叉性，这个问题看起来似乎复杂，没有头绪，但是我们能够认真梳理还是很容易的理出一条主线，其实无论什么方法，都能归入两个大类。一类是以病原体表现型为基础的方法；另一类是以病原体基因型为基础的方法，所以表现型就是病原体直接表型出的一些性状，其物理学性状、生化反应特性、免疫学特性，特性可以通过平板划线分离，生化反应，血性型实验的检测出来。从分子微生物学的角度讲，表现型是病原体基因组，特别是一些活跃的基因经过转入翻译后的外在表现，虽然只能体现病原体基因组的部分特征，但是由于针对其实验技术成熟，操作方便，成本相对低廉，因此，仍然是当今病原体诊断的常规技术，相比之下以基因型为基础的方法更加接近病原体的本质，因为基因组的存在了病原组的全部遗传信息，以基因性为基础的方法大致可以分为基于退性基因的检测，以及基于测序的两大手段。前者主要针对退役性基因，这些基因包含了病原体的某些种系特征，该方法快速特异，但鉴于临床标本千差万别，有时会出现敏感性问题。而后者主要基于病原体ＤＮＡ剪辑系列，可以说做到了触及病原体的本质，是当今所有检测技术的基因标准，但是由于经济成本和标准化的问题还很难广泛推广，不可否认它将是未来诊断技术的趋势和发展方向。 二、以表现型为基础的方法 （一）基因物理学特性和生化反应的诊断 在整个微生物的发展历史中，人类经历了经验时期、现代微生物学时期这几个重要的历史阶段，在1670年荷兰人发明了显微镜，第一次揭示了微生物世界的存在，开始人类进入了实验时期，从那以后至今300多年的时间里，通过多种多样的实验方法来鉴别不同微生物的物种间的不同性质；这其中有形态学的方法最基本的格兰染色，鉴定白喉棒状杆菌的染色。鉴定结核分枝杆菌的抗酸染色，也有基于生化反应的方法，如平板考察肠道细菌对于乳糖分解能力的不同以确定致病菌株，运用了整合了四个生化反应的实验鉴定了不同的肠道杆菌的方法虽然这些方法被视作经费的保留下来再医学上广泛和大量的应用　但是手工操作存在效率偏低的疫病。而随着工业化的推进和科学技术的不断发展，其中很多方法被系统化集成化标准化，许多手工作业被自动化仪器所取代，这样便催生了自动化鉴定技术，手工鉴定和自动化鉴定技术可以说相同原理在不同技术条件下的不同形式，但不可否认无论效率的高低它们都是基于相同的经典微生物学理论。 虽然在高技术条件下的今天，许多手工操作的方法已经濒临淘汰，但是在一些基础条件欠发达的地区，在一些经验性诊断已经相当成熟的疾病面前，经典的手工操作方法以及低技术要求，低成本的独特魅力在高科技的加分中仍然取得了一席之地，上图中为我们展示了几种比较经典的手工操作方法，让我们先来看最左边的一张，这张图片给我们展现给我们的是平板划线分离的方法，将含有多种细菌的菌液图铺在同一个题板上，经过一段时间的培养，可以根据菌落的特性辨别出不同的细菌，在图中我们可以看出两种明显不同的菌落，一种菌落较大，明显来源于不同的菌种，经验丰富的实验者往往能直接通过菌落的颜色、光泽、干湿、外形的信息做出初步的诊断，同时这种方法也是自动化细菌检定仪的第一道工序中间农业的格兰染色，在图中所指区域，可以找到大量格兰阴性的球菌集合。病人不检性生活史、尿急尿痛的尿道刺激征，我们很容易做到林秋菌性尿道炎的诊断，而无需进一步的微生物学检查；第三张图展示的是甲乙丙的三种链球菌在血滴板上不同溶血快的特征，在１２点中方向是不溶血的典型溶血性球菌，在五点中方向生长的是完全溶血的的隐形溶血的，在7点溶血的是不完全溶血的甲型溶血性链球菌，链球菌是常见的人体的致命菌，菌落特征很难区别只有通过溶血的特点才能完全区别，因此血平板的培养