生化探针技术-大学化学-北京大学.pdfVIP

第 19 卷 　第 2 期 大学化学 2004 年 4 月 生化探针技术 赵美萍 　张新祥 　常文保 (北京大学化学与分子工程学院　北京 10087 1) 　　摘要 　介绍了核酸探针 、有机小分子探针和金属离子探针等生化探针技术的基本原理 、发展 现状和趋势 。 ( ) 　　探针 Probe 通常是指针对某种特定 目标物的探测器 ,生化探针可理解为一类能特异性识 别 目标分子并适合直接检测或带有可检测标记物的高效探测试剂 。与一般测定方法相比,生 化探针技术具有专一性强 、灵敏度高 、快速准确等特点 。这些优势使其在生物大分子研究、药 物分析 、司法鉴定 、临床疾病诊断和治疗等方面都发挥出巨大作用 。根据探针本身的化学组成 和性质 ,常见的生化探针有核酸探针 、有机小分子探针和金属离子探针等 。其中发展最早 、应 用最多的是基于核酸分子杂交原理的核酸探针 。有机小分子探针既包括能与蛋白质 、核酸等 生物大分子直接作用的一些染料分子 ,也包括能选择性检测钙离子的螯合剂探针等 ;金属离子 探针中最具代表性的是稀土离子荧光探针试剂 ,在生物和药物分析方面得到广泛应用 。本文 将着重介绍以上 3 类生化探针的基本原理及相应检测技术的发展现状 。 1 　核酸探针[ 1～6] 　　核酸是重要的生物大分子 ,具有典型的双螺旋结构 。不同来源的核酸分子混合后 ,经热变 性再冷却复性的过程中 ,具有相同序列的异源核酸分子间会形成杂交核酸分子 。核酸探针就 是利用核酸分子之间的这种杂交特性 ,将杂交链中的一条用某种可检测的物质标记制成探针 , 用来识别和检测另一条具有互补核酸序列的杂交链 。由于核酸探针与互补链之间的识别作用 是通过大量结合位点间的氢键作用力和碱基专一配对作用实现的 ,因此具有极高的特异性 。 1. 1 　核酸探针的来源和种类 　　核酸探针主要有 DNA 探针 、RNA 探针 、cDNA 探针和寡核苷酸探针等 。前 3 种核酸探针 一般是通过分子克隆获得的 ,称为克隆探针 。寡核苷酸探针是人工合成的碱基数较少的DNA 片段 ,属于短链探针 。寡核苷酸探针的优点是对靶序列变异的识别能力较强 ,因为短探针中碱 基错配会导致杂交体的融链温度显著下降 ,而克隆探针对于单个或少数碱基不配的两个序列 杂交信号差别很小 ,难以区分 。此外 ,寡核苷酸探针还具有杂交时间短 、可一次大量合成和成 本低廉等优点 。由于寡核苷酸探针序列较短 ,随机遇到互补序列的可能性大 ,所以特异性不如 赵美萍 : 北京大学副教授 ,博士 。 张新祥 : 北京大学教授 ,博士生导师 。 常文保 : 北京大学教授 ,博士生导师 。 8 克隆探针 。另外 ,克隆探针可标记的位点比寡核苷酸探针多 ,可获得较强的杂交信号 , 因此灵 敏度较高 。 1. 2 　核酸探针的标记 32 3 35 　　最早采用的标记方法是放射性同位素标记法 ,常用的放射性同位素有 P 、H 和 S 等 。 放射性同位素标记的探针灵敏度较高 ,但由于半衰期限制 ,标记后存放的时间有限 ,另外对操 作者和环境有放射性危害 ,因而近年来越来越多地被非放射性标记技术所取代 。非放射性标 记试剂种类丰富 ,包括金属 、荧光染料 、地高辛半抗原 、生物素和酶等 ,可通过酶促反应 、光促反 应或化学修饰等方法标记到核酸分子上 。目前大多是先制成标记的脱氧核苷三磷酸 dN TP (dA TP 、d GTP 、dC TP 和 d T TP) ,然后采用缺口平移法 、末端标记法 、随机引物法或聚合酶链反 ( ) 应法 PCR 等技术标记到核酸分子上 。 　　缺口平移法的原理是用适当浓度的DNA 酶 Ⅰ在探针 DNA 双链上制造一些缺 口,然后在 DNA 聚合酶 Ⅰ的 5′→3 ′酶活性和 5′→3 ′聚酶活性作用下 ,先切去带有 5′磷酸的核苷酸 , 同时 ( 32 ) γ 将标记的互补核苷酸 如